冷冻保存对精子DNA完整性与氧化应激的影响及褪黑素的保护作用研究

《Libyan Journal of Medicine》：Impact of obstructive sleep apnea–hypopnea syndrome severity on quality of life, anxiety disorders, and productivity in an active population

本文探讨了精子冷冻保存（Cryopreservation）对精子DNA碎片指数（DFI）和活性氧（ROS）水平的影响，并评估了褪黑素（Melatonin）的抗氧化保护作用。研究发现，单次冻融循环可导致DFI和ROS显著升高（p<0.001），且吸烟者DFI更高。褪黑素可适度降低ROS（12%）和DFI（11%），提示其具有一定的保护潜力，但临床意义仍需进一步验证。

　　

引言

全球男性因素不育症影响着17.5%的男性，自1990年以来增加了77%，相当于超过5600万病例。中东和北非（MENA）地区，包括利比亚，不孕症发病率全球最高，总不孕率和原发不孕率分别为22.6%和3.8%。在利比亚，男性不育最常见的原因是精液分析异常、生殖道感染或Y染色体微缺失。精子冷冻保存在辅助生殖技术（ART）中被广泛应用，但冻融过程可能导致氧化应激（oxidative stress）的产生，从而损害精子活力、膜脂质和DNA稳定性。精子DNA碎片（SDF）增加与受精潜力降低、胚胎发育受损和不良妊娠结局相关。因此，最大限度地减少冷冻诱导的损伤仍然是优化ART结局的重要目标。氧化应激被认为是冷冻保存损伤的主要介质。由于精子膜富含脂质、抗氧化能力低且DNA修复能力有限，活性氧（ROS）对精子的危害更大。冷冻保存会诱导ROS产生，因此可能导致DNA链断裂。尽管有几项研究报告了其他人群中的这些效应，但来自北非的数据有限。尽管利比亚普遍使用烟草，但吸烟相关氧化应激和DNA损伤的潜在加剧尚未得到评估。褪黑素是由松果体产生的吲哚胺，是一种有效的抗氧化剂，具有多种保护机制，包括直接清除ROS、增强酶防御能力和稳定线粒体膜。这些效应与精子高度相关，因为精子在冷冻保存过程中极易受到氧化应激的影响。实验研究报告称，褪黑素可以减少精子的氧化损伤，包括结构和DNA损伤。然而，人类精子冷冻保存的临床发现仍然有限、可变且不确定，这为进一步评估提供了理由。本研究旨在探讨单次冻融循环对利比亚正常精子症男性精子DNA碎片指数（DFI）和ROS水平以及其他精液参数的影响。它还探讨了ROS与冻融后DNA损伤的关联、生活方式因素的影响，以及褪黑素补充是否可能在实验条件下减轻冷冻损伤。据我们所知，先前没有研究在利比亚队列中检查这些组合因素；因此，本研究为冷冻保存的氧化反应以及抗氧化剂补充的可能作用提供了初步见解。

材料与方法

研究设计与伦理批准

这是一项前瞻性单中心队列研究，于2024年10月至2025年4月在利比亚班加西的贝鲁特医院生育与生殖医学中心进行。该研究根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第六版）设计，以确保方法标准化。获得了贝鲁特医院（IRB-BH-FRM/2024/009）和利比亚科学院（REC-LA-BIO/0224/033）机构审查委员会的伦理批准，符合《赫尔辛基宣言》和国家数据保护法规。参与者提供了书面知情同意书，其机密性在整个研究过程中受到保护。参与者是从到诊所进行生育力保存或诊断评估的男性中连续招募的。资格是根据WHO标准定义的正常精子症状态确定的。仅考虑正常精子症男性纳入。精子样本在禁欲2-7天后获得，并在冷冻保存前后进行分析。一部分样本在冷冻前用抗氧化剂褪黑素（2 mM）进行预处理。本研究的目标是评估解冻后的DFI、ROS水平和精液参数。此外，我们调查了吸烟的影响以及褪黑素补充可能产生的缓解效应。

参与者招募与样本量

从2024年10月到2025年4月，对转诊至贝鲁特医院生育与生殖医学中心进行冷冻保存或诊断的男性进行资格筛查。使用分类数据的Cochran公式（95%置信度，5%误差幅度，p=0.5），目标样本量最初为209。最终，104名参与者入组，主要原因是医学或生殖条件排除导致的高筛查失败率以及资格标准的应用。尽管数量减少，最终的104人队列为主要结局分析提供了足够的统计效力。资格仅基于筛查精液分析（精子浓度≥16×10⁶/mL，总活力≥42%，形态正常形态>4%）；未应用年龄或BMI阈值。此外，前向运动活力不是入组标准，而是在为冷冻保存收集的研究射精液上作为基线结局进行评估。由于BMI不是资格标准，队列包括正常体重、超重和肥胖参与者，BMI作为协变量纳入分析。我们排除了出现白细胞精子症（≥1×10⁶ WBC/ml）、少精子症（精子浓度<15百万/ml）、严重弱精子症（前向运动活力<32%）或畸形精子症（正常形态<4%）的参与者。其他排除标准是存在全身性疾病、睾丸或生殖器感染、药物滥用、既往接触性腺毒素（如辐射和工业化学品）、临床精索静脉曲张、阴囊创伤史以及使用影响精子发生的药物。

精液收集与基线评估

要求参与者在样本收集前禁欲2至7天。男性通过手淫在实验室相邻的温度控制房间内将精液样本收集到无菌预标记容器中。所有样本在收集后5分钟内运送到实验室，并在37°C下孵育最多60分钟以确保液化。记录精液参数，包括体积、颜色和稠度。同时，使用pH计（每天用pH 4.0、7.0和10.0缓冲溶液校准）测量pH值。通过抽吸测量线长度来测量粘度，并分类为水样、中度或高粘度。精液分析根据WHO建议进行。精子浓度在5-10 μL等分试样中测量，用精子活性培养基稀释1:20或1:100，然后在改良的Neubauer血细胞计数板上计数。通过将10μL精液滴放在预热的显微镜载玻片上，并在37°C下通过相差显微镜检查来评估活力。精子被分类为快速前向运动（A）、慢速前向运动（B）、非前向运动（C）或不活动（D），总活力（A+B+C）的参考值≥42%，前向运动活力（A+B）≥30%。形态学根据Tygerberg标准在涂片上用巴氏染色法染色并风干后评估。每张载玻片至少分析200个精子；如果至少≥4%的精子具有正常形态，则形态学被视为正常。精子活力测试通过伊红-苯胺黑染色进行，可以区分活精子（未染色）和非活精子（粉红色染色）。通过Endtz测试评估的过氧化物酶阳性WBC，如果其水平低于1×10⁶ WBC/ml，则被视为在正常范围内。在冷冻保存日，收集新的射精液（'研究射精液'）并进行分析。该样本的值（包括前向运动活力）可能与筛查样本不同，因为正常的个体内生物学和分析前变异（例如禁欲间隔、液化/粘度、评估时间和温度）。

试剂与耗材

我们使用精子活性培养基（Gynemed，德国）用于精子的洗涤和处理。这种培养基含有平衡盐和离子、缓冲液如HEPES或碳酸氢盐，并补充有人血清白蛋白（HSA）以支持精子在体外处理过程中的活力和存活。Sperm Store（Gynemed，德国）用于标准冷冻保存，添加了基于甘油的冷冻保护剂，并补充了抗氧化剂，如维生素E和谷胱甘肽，以减少对精子的氧化损伤。此外，使用SCD方法根据WHO指南和制造商说明（Candore，印度）评估精子DNA碎片。使用Sperm Freeze Solution（Vitrolife，瑞典）进行快速冷冻，这是一种专有溶液，含有渗透性和非渗透性冷冻保护剂，旨在实现广泛的冷却和超微结构稳定性在最低温度下。我们使用实验室无菌兼容一次性用品，包括预灭菌标记塑料吸管（IMV Technologies，法国）、可变体积微量移液器和DNase/RNase-free移液器吸头（Eppendorf，德国）、改良Neubauer血细胞计数器（Hausser Scientific，美国）、碱石灰玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，美国）和微量离心管（Eppendorf，德国）。我们还使用了对温度敏感的培养箱（Binder，德国）用于精液液化和短期孵育，而控制速率冷冻（速率-1°C/分钟）和长期储存使用可编程冷冻单元（Cryologic, Planer, UK）和液氮罐（Taylor-Wharton, USA）在-196°C下进行。解冻使用设置在37°C的恒温水浴（Grant Instruments, UK）进行。精液分析及相关检测使用Eppendorf 5810 R离心机和Nikon Eclipse E200相差/明场光学显微镜（Nikon, Japan）进行。

冷冻保存方案

精液液化后在室温（22–25°C）下平衡10分钟。使用逐步添加等体积的冷冻保护剂Sperm Store培养基（Gynemed，德国）进行冷冻保存，每次添加后轻轻滴定以避免渗透压 shock。平衡10分钟后，将精液-冷冻保护剂混合物装入塑料吸管（0.5 ml），密封并放入可编程冷冻机中，以每分钟-1°C的速率降温直至达到-80°C。长期储存在于-196°C下进行，将吸管直接浸入液氮中。为了快速冷冻样本，首先在室温下保持10分钟，然后暴露于液氮蒸气中，随后将样本浸入液氮中进行长期储存。将等体积的Sperm Freeze Solution（Vitrolife，瑞典）缓慢添加到液态精液中。然后将样本装入0.5 ml吸管，并悬停在液氮上方1-3厘米处约30分钟以实现气相冷却。预冷却后，将吸管浸入液氮中，然后储存（必要时）直至使用。

解冻与解冻后样本处理

冷冻精液样本的解冻根据制造商方案（SpermFreeze? Solution, Vitrolife AB, Sweden）进行，采用在37°C水浴中浸泡5分钟或在环境室温（22–25°C）下平衡30分钟。使用为此目的设计的低温工具取出冷冻吸管，并在37°C水浴中解冻5分钟或在室温（22?25°C）下解冻30分钟，如制造商所推荐。解冻后的内容物逐步转移到无菌管中，然后用1 ml精子活性培养基稀释。将悬浮液以1500 rpm离心10分钟。将上清液转移到新管中并弃去，而沉淀物则非常小心地重悬。冻融循环后，按照相同的基本方案重新评估射精液，以便每个样本的冷冻保存前和冷冻保存后评估具有可比性。

褪黑素补充方案

褪黑素（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）制备为浓缩储备液，避光保存于-20°C。在使用当天，将等分试样用精子活性培养基稀释。在与冷冻保护剂混合之前立即将其添加到指定的射精液等分试样中，以达到2 mM的最终浓度。选择2 mM褪黑素浓度是基于最近的人类精子冷冻保存研究证明其有效性。样本在室温下保持10分钟，如同冷冻前方案。然后继续进行冷冻保存，使用带有Sperm Store的控制速率方法或带有Sperm Freeze Solution的快速冷冻方法，无需改变。来自同一射精液的匹配对照等分试样在没有褪黑素的情况下平行处理。解冻和所有解冻后评估以相同方式对处理样本和对照样本进行。

ROS定量

通过鲁米诺增强化学发光法测量精浆ROS，使用CE标记的单管发光计（Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA），具有光子计数检测和自动信号积分。根据既定的临床方案使用未处理精液发光测定法进行测定。完全液化后，轻轻混合精液；将400 μL等分试样分配到一次性管中。解冻后测试在解冻后15分钟内测量，操作相同。通过向每个部分添加10 μL鲁米诺工作溶液（在DMSO中5 mmol/L；Sigma-Aldrich/Merck, St. Louis, MO, USA）触发化学发光。阴性对照包含PBS（Gibco/Thermo Fisher Scientific）加鲁米诺，而阳性对照包含PBS、鲁米诺和H₂O₂（在PBS中10 mmol/L储备液，VWR International；最终25 μmol/L）。每个管采集200-300秒， resulting 60秒的稳定平台取平均值并记录为相对光单位（RLU）s^?1；从这些值中减去空白值。由于所有测定均在相同精液体积和鲁米诺浓度下进行，数据根据单管发光测定法的建议以RLU/s（而非每10⁶精子的RLU/s）呈现，用于个体内比较。该程序可靠地检测到冷冻诱导的ROS升高。我们报告了（平均增加从约3.2×10³到约14.7×10³ RLU/s在ROS子集中）并与鲁米诺精液ROS测试的经过验证的临床实施一致。

数据收集、管理与质量控制

参与受试者的信息前瞻性地记录在标准化的病例报告表上，这些表格专门设计用于记录临床和实验室特征。这些包括人口统计信息、生活方式、相关医疗史、精液参数、冷冻保存方法学和DNA碎片标志物。信息收集在安全可靠的电子记录中，仅授权用户可访问。使用经过验证的实验室信息管理系统（LIMS）进行数据处理和质量控制，具有双录入验证和审计跟踪。每个数据条目由训练有素的人员手动检查准确性。所有实验室设备每季度进行校准，以确保程序的可靠性。精子形态学和DNA碎片测试按照WHO（2021）建议进行了能力验证。遵循数据保护原则，所有结果均符合GDPR和机构伦理委员会的指导方针。个人数据存储在单独服务器中并安全加密，与分析数据集无连接。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics v27（IBM Corp., Armonk, NY）分析数据。连续变量表示为均值±SD或中位数[IQR]，分类数据表示为n（%）。使用Shapiro–Wilk检验和Q–Q图检验正态性，并使用Levene检验检验方差齐性。当不满足参数检验的条件时，使用非参数检验。分类变量如吸烟和饮酒状态被虚拟编码（例如吸烟者=1，非吸烟者=0）以便纳入相关和回归分析。使用配对t检验或Wilcoxon符号秩检验进行受试者内比较（前/后）。使用独立t检验、Welch校正（在方差不齐的情况下）或Mann–Whitney U检验（在非正态分布的情况下）分析组间比较（例如褪黑素vs对照）。分类变量通过χ2或Fisher精确检验进行比较。使用Pearson's r或Spearman's ρ计算精液参数、ROS和DFI的相关性分析，取决于数据的分布和线性，并给出95%置信区间。进行多变量线性回归以评估DFI的预测因素：（i）基线DFI对年龄、BMI、吸烟和饮酒；（ii）解冻后DFI对基线DFI和相同的协变量。检验VIF（<5截断值）以检验多重共线性。回归结果以标准化β、R2和偏R2呈现。效应大小包括Cohen's d_x（配对）、Hedges' g（独立）和标准化β（回归），均带有95% CI。结果在α=0.05（双尾）时显著。结局指标是冷冻保存后（i）DFI（主要终点）或精液参数（主要终点和次要终点）变化；探索性分析报告时未对多重检验进行调整。事后敏感性分析显示，在n=104配对样本下，研究有80%的效力检测到0.28 SD（Cohen's d_x）的效应大小。对于ROS子集（n=20），可检测的受试者内效应大小约为0.63 SD。最小可检测相关性为|r|≈0.27（n=104）和|r|≈0.59（n=20）。

结果

队列基线特征

我们分析了包含104名正常精子症男性的研究队列的基线特征（表1）。我们确定平均年龄为35.1±5.8岁（范围：22–54），平均BMI为26.5±4.0 kg/m2（范围：19.2–36.8）。根据BMI分类，41%体重正常，38%超重，18% I级肥胖，3% II–III级肥胖。参与者中，57%为当前吸烟者，12%为既往吸烟者，31%为从不吸烟者。关于饮酒，6.7%为当前使用者，13%为既往使用者，80.3%从未使用过酒精。没有参与者有慢性全身性疾病、睾丸疾病或已知可能影响精子发生的药物史。这些结果为健康人群提供了基线。这些结果为后续的精液分析建立了一个临床健康的基线人群。

冷冻保存前精液质量基线

根据WHO标准，在射精后60分钟内评估基线精液参数。精液体积在1.50至5.60 ml之间，均值±SD为2.96±0.79 ml（CV=27%，偏度=0.37，表2），没有样本低于WHO下限参考值1.4 ml。平均精子浓度为49.22±18.21×10⁶/ml（范围：18–118×10⁶/ml；CV=37%；偏度=0.69），仅3%的样本低于WHO阈值16×10⁶/ml。总精子数平均为145±60×10⁶（范围40?310×10⁶），全部超过WHO截断值39×10⁶，15%的男性计数高于200×10⁶。平均总活力（前向运动+非前向运动）为53.8±14.7%（范围：18–86），而非前向运动活力平均为22.26±10.88%（范围：5%–55%）。平均前向运动活力为31.06±13.18%（最低10，最高70），57%的样本低于WHO下限32%，而平均非前向运动活力为22.26±10.88%（最低5，最高55%）。使用SCD测试测量的平均DFI为46.34±18.32%（范围：18.3–82.5%），76%的队列超过临床相关阈值30%。相关性分析表明，精子浓度与总活动精子数有强相关性（r=0.892，p<0.001），而前向运动活力也与总活动精子数相关（r=0.508，p<0.001）。发现前向运动活力和非前向运动活力之间存在弱但显著的负相关（r=–0.262，p<0.01）。相比之下，DFI与精子浓度（r=0.106，p=0.286）或总活动精子数（r=0.145，p=0.141）没有显著关联。值得注意的是，在冷冻前和解冻后DFI之间观察到强相关性（r=0.973，p<0.001），如表3所示并在图1中说明。

冷冻保存诱导的精液质量变化

在104个样本冷冻前后配对比较中，检测到精液质量参数的显著变化（表4）。我们观察到射精液体积从冷冻前的2.96±0.79 ml减少到解冻后的1.00±0.00 ml（Δ=–1.96 ml；t=25.41，p<0.001）。我们还发现精子浓度从49.22±18.21增加到72.92±27.85×10⁶/ml（Δ=+23.70×10⁶/ml；t=–19.70，p<0.001）。前向运动活力从31.06±13.18%下降到18.41±10.18%（Δ=–12.64%；t=19.73；p<0.001），而非前向运动活力从22.26±10.88%下降到18.46±10.89%（Δ=–3.80%；t=8.85；p<0.001）。不活动精子从1.88±1.42%轻微增加到2.10±0.82%，但该差异无统计学意义（Δ=+0.22%；p=0.122）。我们观察到冷冻前后总活动精子数值没有显著变化（27.33±14.14 vs. 28.35±16.71×10⁶；Δ=+1.02×10⁶；t=–1.68，p=0.096）。此外，我们观察到活力从（75.4±17.2%）轻微下降到（73.0±17.3%）（Δ=–2.4%；t=2.32，p=0.022）。精子染色质完整性也受到影响，DFI从冷冻前的46.34±18.32%增加到解冻后的59.99±23.02%（Δ=+13.65%；t=–20.77；p<0.001）。解冻后，91%的样本超过30% DFI阈值。

生活方式对精液质量的影响

在分析结构化问卷和临床数据后，我们发现生活方式因素影响精液质量参数。烟草使用对精液质量参数有可测量的影响，其中对精子染色质完整性的影响最大。与从不吸烟者相比，吸烟者在基线时显示出显著更高的平均DFI水平（平均DFI：57.2±12.6% 对比 32.1±14.5%，t=9.46，p<0.001；Cohen's d=1.84），如表5所示。冷冻保存后，我们观察到进一步更高的增加，吸烟者的解冻后DFI率为75.9±13.4%，而从不吸烟者为39.2±15.0%（t=13.1，p<0.001；Cohen's d=2.53）。相比之下，我们观察到吸烟者和非吸烟者之间在射精量（2.91±0.70 ml vs. 3.00±0.85 ml；t=0.57，p=0.57）、精子浓度（48.0±17.5×10⁶/ml 对比 50.8±17.3×10⁶/ml；t=0.71，p=0.48）或前向运动活力（30.7±13.1% vs. 31.4±13.3%；t=0.24，p=0.81）方面没有差异。关于饮酒，我们未观察到与精液参数的关联。其中，只有7名参与者（6.7%）是当前饮酒者。在这个亚组中，我们发现与非使用者相比，在DFI、活力、精子浓度或射精量方面没有显著差异（所有p>0.10；Cohen's d<0.35）。

基于回归的精子DNA损伤预测因素

我们使用基于回归的分析来识别冷冻保存前后精子DNA碎片的独立预测因素。使用多元线性回归与向前输入协变量（年龄、体重、身高、BMI、饮酒和吸烟）显示，吸烟是基线DFI的唯一显著预测因素，解释了DFI中44%的方差（偏R2=0.44；β=0.68；t=9.06；p<0.001）。在解冻后，将DFI作为因变量输入，基线DFI是最显著的预测因素，解释了55%的方差（偏R2=0.55；β=0.81；t=12.82；p<0.001）。我们还观察到吸烟解释了解冻后DFI中额外的4%方差（偏R2=0.04；β=0.20；t=4.11；p<0.001）。相比之下，年龄、体重、身高、BMI和饮酒消费不能预测解冻后DFI（所有p≥0.18）。活力与吸烟状态对解冻后DFI的关联如图2所示，回归系数和p值呈现在表6中。

褪黑素补充对精子冷冻保存过程中氧化应激和DNA完整性的影响

我们评估了20份射精液以定义与人类精子冷冻保存相关的氧化应激特征。我们检测到ROS水平在冷冻后增加了近5倍，从冷冻前的3.2±1.1×103 RLU/s上升到解冻后的14.7±4.2×103 RLU/s（t=11.3，p<0.001；Cohen's d=2.52），对应于约4.6倍的增加。这些实验总结在表7中，并强调所有批次在冷冻保存后都与氧化应激的急性激增相关，如图3中单个样本所示。我们还发现在这20份射精液的子集中，DFI从冷冻前的45.8±17.9%显著增加到解冻后的59.5±22.8%（t=8.9，p<0.001），对应于1.3倍的相对增加。此外，发现解冻后ROS产生与DFI之间存在显著正相关（r=0.68，p=0.004）（图4）。这些结果证明了ROS对染色质损伤的剂量依赖性诱导。为了确定抗氧化剂补充在减轻冷冻保存诱导的氧化和基因毒性应激方面的效果，进行了一项配对实验（n=20份射精液）。每份精液样本分成两等分：一份进行标准冷冻保存，另一份在冷冻前用2 mM褪黑素处理。解冻后ROS水平在褪黑素处理组中比未处理对照组低12%（p=0.045）。同时，接受褪黑素的男性DFI降低了11%（p=0.004）（图5）。此外，相关性分析表明，解冻后ROS水平构成了DFI差异（ΔDFI）中观察到的差异的46%部分，r=0.68（p<0.001）。

讨论

在这项研究中，我们检测到冷冻保存导致DFI和ROS显著升高。解冻后DFI和ROS之间存在强正相关。吸烟者在冷冻保存前后DFI均显著高于非吸烟者。值得注意的是，在冷冻保存培养基中补充褪黑素导致解冻后DFI和ROS水平小幅但统计学上显著的降低。

精子冷冻保存极大地损害了精子DNA的完整性。据报道，解冻后诱导精子DFI增加约26%，而我们的数据显示增加了29个百分点，超过了最近荟萃分析中观察到的7-8个点的增加。这些差异可能是由于患者队列、测定方法或冷冻方案所致，而非反映基本的生物学效应。我们的结果表明氧化应激是精子DNA损伤的关键因素。我们观察到ROS水平与DFI之间存在强相关性，这与ROS引起DNA单链断裂和碱基加合物的已知作用一致。这些发现支持了早期关于冷冻诱导DFI增加的报告，并强调了氧化应激作为主要途径。

我们的结果强调了吸烟对精子染色质完整性的负面影响。吸烟者在基线和解冻后的DFI均显著高于非吸烟者，这与其他将烟草使用与较差精液质量和较高精子DNA损伤相关联的观察性研究一致。重度吸烟（>10-20支/天）导致精子计数、活力和形态更大幅