Senataxin（SETX）RNA/DNA解旋酶在抗原受体基因多样化过程中确保V(D)J重组保真性的新机制

《Science Signaling》：Senataxin promotes recombination fidelity during antigen receptor gene diversification

本研究为揭示V(D)J重组中潜在的冗余修复因子，通过CRISPR-Cas9筛选发现RNA/DNA解旋酶SETX在ATM抑制背景下对重组至关重要。实验证实SETX缺失导致杂交接头（HJ）增多、重组保真性下降，并与XLF/ATM协同防止Igh等位基因间异常连接。此发现阐明了SETX在淋巴细胞发育中维持基因组稳定性的新功能，为免疫缺陷机制研究提供了新视角。

　　

在适应性免疫系统的建立过程中，B淋巴细胞和T淋巴细胞需要通过一种称为V(D)J重组的精确基因重组机制，来产生能够识别无数病原体的多样化抗原受体。这个过程就像是基因的“剪贴游戏”，将分散的可变区（V）、多样区（D）和连接区（J）基因片段组装在一起。重组过程由RAG1/RAG2核酸酶复合物启动，它在特定的重组信号序列（RSS）处切割DNA，产生双链断裂（DSBs）。随后，细胞通过一种主要的DNA修复途径——非同源末端连接（NHEJ）——将这些断裂的DNA末端准确连接起来，形成功能性的抗原受体基因。然而，这个看似直接的过程背后隐藏着复杂的调控网络。已知NHEJ核心因子（如KU70/80, XRCC4, LIG4等）的缺失会严重损害V(D)J重组，导致严重的联合免疫缺陷。但有趣的是，某些因子如XLF（XRCC4-like factor）或激酶ATM（ataxia-telangiectasia mutated）的缺失，在单独情况下仅引起轻微的免疫缺陷，这表明修复通路中存在功能冗余，可能掩盖了其他关键调控因子的作用。那么，是否存在尚未被发现的、确保V(D)J重组保真性的关键因子？这些因子又是如何与已知通路协同工作的？这些问题吸引着科学家们不断探索。

为了回答这些问题，由Libri等人领导的研究团队在《Science Signaling》上发表了一项研究，他们采用了一种强大的基因筛选工具——靶向CRISPR-Cas9敲除筛选，旨在发现参与V(D)J重组的新因子。研究人员在一种可诱导RAG表达的祖B细胞系（v-Abl pro-B cells）中进行了筛选，比较了在正常条件和ATM激酶抑制剂（ATMki）处理条件下，成功完成重组与重组失败的细胞群体中向导RNA（gRNA）的富集情况。这种在“敏感化”（ATM功能被部分抑制）背景下的筛选策略，有助于揭示那些功能可能被ATM活性所掩盖的因子。

这项研究主要运用了几项关键技术：1）靶向CRISPR-Cas9敲除筛选：使用定制的包含1865个基因（主要是DNA损伤反应相关因子）的gRNA文库，在RAG诱导的祖B细胞模型中进行功能丧失筛选。2）V(D)J重组报告系统：利用染色体整合的逆转换（pMX-INV）和缺失型（pMX-DEL）报告基因，通过流式细胞术和Southern印迹分析重组效率和中间产物。3）基因工程小鼠模型：利用国际小鼠基因敲除联盟提供的Setx基因敲除小鼠，并与Xlf^-/-小鼠杂交，获得双敲除小鼠，以在体研究淋巴细胞发育。4）高通量基因组易位测序（HTGTS）：以Jκ1编码端为“诱饵”，在全基因组范围内定量分析Igκ位点的V-J重组连接事件，特别是正常编码接头（CJ）与异常杂交接头（HJ）的比例。5）DNA荧光原位杂交（DNA-FISH）：在刺激后B细胞的染色体铺片上，使用Igh位点特异性探针检测染色体断裂和易位，评估类别转换重组（CSR）过程中的基因组不稳定性。此外，还辅以RT-qPCR、Western blotting、体外B细胞类别转换重组实验、胸腺细胞体外重组实验等多种分子和细胞生物学技术。

CRISPR-Cas9筛选鉴定SETX为V(D)J重组的新候选因子

研究人员通过筛选，成功鉴定出已知的V(D)J重组必需基因（如Rag1, Rag2, Xrcc4, Xrcc5/KU80, Xrcc6/KU70, Lig4, Prkdc/DNA-PKcs等），验证了筛选系统的可靠性。值得注意的是，在ATM激酶被抑制的条件下，靶向Nhej1（编码XLF）的gRNA显著富集，这与已知的ATM-XLF功能冗余一致。在众多候选基因中，编码RNA/DNA解旋酶的Senataxin（Setx）基因脱颖而出。虽然它在野生型筛选条件下排名不显著，但在ATM抑制条件下排名大幅提升（第18位），提示SETX的功能在ATM活性缺失时变得尤为重要。

SETX促进逆转换V(D)J重组，尤其在XLF缺失背景下

为了验证筛选结果，研究者在祖B细胞系中构建了Setx基因敲除（Setx^-/-）克隆。利用逆转换报告基因（pMX-INV）进行检测，发现Setx^-/-细胞的重组效率相比野生型细胞下降了约30%，而在加入ATM抑制剂后，缺陷加剧至70%。Setx的缺失并不影响Rag1/Rag2或Igκ胚系转录本的表达水平。更重要的是，当Setx缺失与Xlf缺失组合时（Setx^-/- Xlf^-/-），逆转换重组效率出现协同性的大幅下降（从野生型的43.8%降至6.6%），并且Southern印迹检测到更多未修复的编码端（CEs），表明DSB修复严重受损。然而，在缺失型报告基因（pMX-DEL）实验中，Setx单敲或双敲细胞的重组效率与相应对照组相比没有显著差异，提示SETX对逆转换重组的影响更为显著。

SETX在小鼠体内促进逆转换V(D)J重组

为了研究SETX在生理条件下的功能，研究者使用了Setx基因敲除小鼠。与细胞系中的轻微表型一致，Setx^-/-小鼠的B细胞和T细胞发育基本正常。然而，当与Xlf^-/-背景结合时，Setx^-/- Xlf^-/-双敲小鼠表现出胸腺中CD4^-CD8^-双阴性（DN）T细胞比例的轻微增加，以及DN3向DN4阶段过渡的缺陷，这通常暗示T细胞受体β（Tcrβ）链基因重组的效率降低。为了直接评估体内重组效率，研究者从成年小鼠胸腺中分离出DN细胞，并用逆转换报告病毒进行感染。结果证实，Setx^-/-胸腺细胞的重组效率显著低于野生型，而Setx^-/- Xlf^-/-双敲细胞则表现出更为严重的缺陷。进一步分析内源性Tcrβ位点，发现唯一通过逆转换重组的Vβ31基因片段的使用频率在Setx^-/-和双敲小鼠的胸腺细胞中显著降低，而通过缺失方式重组的Vβ2片段的使用则不受影响，这再次支持了SETX对逆转换重组的特异性作用。

SETX通过抑制杂交接头形成促进V(D)J重组保真性

逆转换重组需要同一个DNA分子上的四个断裂末端（两个编码端和两个信号端）被精确地“配对”连接，形成一个编码接头（CJ）和一个信号接头（SJ）。如果这种协调被破坏，就可能发生错误的连接，例如编码端与另一个信号端连接，形成所谓的杂交接头（HJ）。研究者通过PCR和Southern印迹分析发现，在Setx^-/-祖B细胞中，报告基因上的HJ形成显著增加。同样，在Setx^-/-和双敲小鼠的胸腺细胞中，Vβ31-to-DJβ2逆转换重组产生的HJ也明显增多。为了在基因组水平评估重组保真性，研究者对野生型和Setx^-/-小鼠脾脏B细胞中的Igκ位点进行了HTGTS分析。结果显示，虽然总的Vκ-to-Jκ1重组效率没有显著变化，但Setx^-/-细胞中Jκ1编码端与Vκ信号端形成的HJ比例比野生型细胞高出一倍，且这种现象在缺失型和逆转换型的Vκ片段中均存在。对连接处序列的分析表明，SETX缺失并不影响DNA末端的处理（如微同源使用或插入突变），说明其作用不在于末端加工，而更可能在于防止末端的错误配对。

SETX在类别转换重组中防止Igh介导的易位

类别转换重组（CSR）是B细胞抗体功能多样化的另一个关键过程，由活化诱导胞苷脱氨酶（AID）在Igh位点的转换区（S regions）引入DSBs，进而通过NHEJ完成重组。体外刺激脾脏B细胞实验表明，Setx^-/-和Setx^-/- Xlf^-/- B细胞仍能进行有效的IgM向IgG1的类别转换，与相应对照组无显著差异。然而，通过DNA-FISH对分裂中期染色体进行分析，却发现了一个关键差异：尽管Setx^-/- B细胞中Igh位点的染色体断裂数量与野生型相似，但其Igh介导的染色体易位（特别是涉及两条12号染色体的着丝粒融合，即Igh:Igh易位）频率显著增加了约五倍。这种特殊的易位类型可能源于两个Igh等位基因上AID诱导的DSB之间的异常连接，具有导致基因组不稳定性加剧的潜力。

研究结论与意义

本研究通过系统的遗传学筛选和功能验证，揭示了RNA/DNA解旋酶SETX在抗原受体基因多样化过程中的重要作用。其主要结论是：SETX并非V(D)J重组的绝对必需因子，但它通过促进RAG诱导的DSB末端的正确配对和连接，显著提高了重组的保真性。其功能与ATM和XLF存在协同作用，尤其在逆转换重组和XLF缺失的敏感背景下更为关键。SETX的缺失导致杂交接头（HJ）的形成增加，表明它有助于维持重组后切割复合物（PCC）的稳定性，防止DNA末端的错误归位。此外，在类别转换重组中，SETX虽然不影响重组效率，但能有效抑制Igh等位基因间的异常连接，从而充当了基因组稳定性的“守护者”。

这项研究的科学意义重大。首先，它发现并证实了SETX是调控V(D)J重组保真性的一个新因子，增进了我们对淋巴细胞发育中DNA修复复杂网络的理解。其次，它解释了为何SETX缺失的人类患者（如AOA2）虽患有神经系统疾病，却未表现出明显的免疫缺陷——SETX的功能很可能是冗余的，或者其缺陷在生理条件下被其他因子所补偿。第三，研究揭示了SETX在防止淋巴细胞中由AID活性引起的致癌性染色体易位方面的潜在作用，为理解相关血液系统肿瘤的发病机制提供了线索。最后，研究所采用的CRISPR筛选结合体内外功能验证的策略，为发现其他免疫相关DNA修复因子提供了范例。总之，这项研究不仅深化了对适应性免疫系统基础生物学过程的认识，也为相关疾病的研究开辟了新的方向。