柑橘黄龙病病原菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”与“Candidatus Liberibacter africanus”中共享的新型第五类原噬菌体的基因组特征及其进化意义

《Applied and Environmental Microbiology》：Genomic footprint of a shared Type 5 prophage in “Candidatus Liberibacter asiaticus” and “Candidatus Liberibacter africanus,” two destructive bacterial pathogens of citrus Huanglongbing

本研究首次在留尼汪岛柑橘黄龙病（HLB）病原菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）的环状基因组中发现并鉴定了一个新型第五类原噬菌体（P-V1R1-5），该噬菌体与非洲黄龙病病原菌“Ca. Liberibacter africanus”（CLaf）中原有的噬菌体高度相似，揭示了HLB相关致病菌种间通过水平基因转移共享原噬菌体序列的首个证据。研究通过比较基因组学和PCR筛选，证实该噬菌体在留尼汪岛CLas及马达加斯加与留尼汪的CLaf菌株中广泛分布，并具有完整的溶原性和裂解性周期遗传元件，为理解原噬菌体在HLB致病菌适应性进化中的作用提供了新视角。

　　

测序、系统发育与基因组特征

研究通过对感染了CLas的非洲木虱（Trioza erytreae）成虫进行DNA提取，结合牛津纳米孔（Nanopore）长读长和Illumina短读长测序技术，成功组装出来自留尼汪岛的CLas菌株V1R1的首个环状基因组。该基因组大小为1,271,573 bp，GC含量为36.58%，包含3个rRNA操纵子、44个tRNA以及1,129个编码序列（CDSs），其中预测有76个Sec依赖效应子（SDEs）。系统发育分析基于54个CLas全基因组，结果显示留尼汪岛的两个CLas基因组（包括V1R1）形成一个高支持度的单系群。

留尼汪CLas菌株含有与CLaf菌株同源的原噬菌体区域

在V1R1基因组中，研究人员预测并鉴定出三个原噬菌体样序列。一个被归类为可疑的、17,016 bp长的残余第四类原噬菌体（P-V1R1-4）。另外两个是完整的噬菌体样序列，长度分别为37,934 bp和40,501 bp。较短的序列（P-V1R1-1）与已知的CLas第一类原噬菌体（如P-YN-1）具有高度相似性（平均核苷酸一致性ANI = 0.970），含有35个预测CDSs，GC含量（41.09%）略高于基因组平均水平。

而最长的原噬菌体序列（P-V1R1-5）与已知的CLas原噬菌体同源性较低（与最接近的P-JXGC-3的ANI为0.726），但与从CLaf基因组（P-PTSAPSY-1, P-Ang37-1, P-Zim-1）中重新预测出的原噬菌体表现出高度相似性（ANI为0.972-0.990）。系统发育分析也显示P-V1R1-5与这些CLaf原噬菌体形成一个簇。此外，该原噬菌体拥有一个推定的附着位点序列（TGGTGCACCCGACAG），该序列在除YNHK-2外的所有测试CLas基因组中都被发现，包括另一个来自留尼汪的CLas草图基因组（ReuSP1）。测序读长覆盖分析表明P-V1R1-5区域深度（209×）与基因组平均深度（191×）接近，支持其作为单拷贝元件稳定整合在基因组中。因此，P-V1R1-5被确定为一个新的CLas第五类原噬菌体。

P-V1R1-5含有46个预测的CDSs，平均GC含量为39.73%。其中87%的蛋白质与CLaf原噬菌体编码的蛋白质具有同源性，但13%的蛋白质（6个）是P-V1R1-5所独有的。值得注意的是，P-V1R1-5编码的蛋白质与CLas中已知的其他类型原噬菌体编码的蛋白质没有同源性。使用VirClust工具重新注释发现，P-V1R1-5含有与噬菌体休眠和/或诱导相关的阻遏蛋白/抗阻遏蛋白编码基因（如RecA、RecX、Bro-N家族抗阻遏蛋白）、与溶原性整合相关的整合酶基因、以及与裂解周期相关的基因，包括一个独特的孔蛋白（holin）和一个推定的内溶素（endolysin）基因，表明其可能仍具备溶原性和裂解性周期的能力。此外，还鉴定出多个与病毒粒子合成和DNA结合相关的基因。其中一个CDS（DFOLPJBN_00150）编码一个推定的分泌性脂蛋白，预测其含有25个氨基酸长的信号肽，可能作为毒力因子或保护因子。

P-V1R1-5样原噬菌体序列的分布与变异

通过针对P-V1R1-5不同区域设计的10对特异性引物进行PCR扩增筛选，研究人员调查了该原噬菌体在留尼汪岛和马达加斯加的HLB相关“Ca. Liberibacter”物种中的分布。结果显示，在留尼汪岛测试的28个CLas菌株中，有24个（85.7%）含有一个P-V1R1-5样的原噬菌体或其变体。这些菌株呈现出五种不同的原噬菌体PCR谱型（1-5型），其中谱型1和2最为常见。所有测试的来自留尼汪和马达加斯加的11个CLaf菌株都扩增出了至少8个目标区域，显示出谱型2和4。值得注意的是，在所有检测到该原噬菌体的菌株中，有六个目标区域（由引物VC, VD, VH, VJ, VO, VQ扩增）是最为保守的。这种异质性表明菌株可能携带该原噬菌体的较小部分，或者该原噬菌体已经发生了足够大的进化，导致其部分基因无法被设计的引物扩增。

讨论

本研究通过从头组装方法，首次在留尼汪岛的CLas菌株V1R1中鉴定出一个新的第五类原噬菌体（P-V1R1-5）。该发现意义重大，因为此前此类原噬菌体仅在CLaf基因组中有报道，而在CLas中属首次发现。PCR筛选结果表明该原噬菌体或其变体在留尼汪的CLas种群以及留尼汪和马达加斯加的CLaf种群中广泛存在。由于之前的研究表明留尼汪的CLas菌株均携带第一类原噬菌体和残余的第四类原噬菌体，这个新的第五类原噬菌体为在该岛屿上使用原噬菌体分型系统区分菌株提供了一个有趣的替代标记。五种PCR谱型的发现与其他CLas原噬菌体类型中存在的变异情况一致。

P-V1R1-5的基因组成，特别是其与CLaf原噬菌体的高度相似性以及共享的推定附着位点，表明这种噬菌体的病毒颗粒能够识别并通过相同机制感染这两个物种。其基因内容支持它是一个温和噬菌体，能够进行溶原性和裂解性周期之间的转换。内含的裂解相关基因（如孔蛋白和内溶素）表明其具有产生新的病毒颗粒并裂解细菌细胞的能力，这为利用噬菌体衍生策略（如内溶素）控制HLB提供了潜在可能性。预测的分泌性脂蛋白可能作为一种效应子或参与超感染排斥。

研究结果对先前关于CLaf原噬菌体（如P-Zim-1）含有与CLas第一/二类原噬菌体同源的过氧化物酶基因的描述提出了质疑，因为P-V1R1-5及其同源CLaf原噬菌体中并未发现这些基因。同样，研究也未在这些原噬菌体中确认存在完整的CRISPR/Cas系统。这些差异强调了在基于序列同源性分配基因功能和使用最新工具进行预测时需要更严格的标准。

这种种间共享的原噬菌体序列之所以在留尼汪岛被发现，很可能与该岛屿独特的环境有关。留尼汪是全球少数几个同时存在CLas、CLaf及其昆虫媒介（亚洲柑橘木虱和非洲柑橘木虱）的地区。在海拔800-950米的共生区域，这两种病原菌存在相互作用，甚至有时共同感染同一寄主，这为噬菌体介导的基因转移创造了条件。而在巴西等地，尽管CLas和CLam也曾共存，但并未报道共享原噬菌体，可能与CLas在当地占据绝对优势、种间相互作用频率较低有关。

总之，该研究不仅扩展了我们对留尼汪岛CLas基因组多样性的认识，更重要的是，首次提供了HLB相关“Ca. Liberibacter”物种间共享完整原噬菌体序列的证据，突显了附属基因组（accessory genome）尤其是水平转移元件在这些共生致病菌多样性、进化和生物学中的关键作用。研究也强调了获得更多高质量的环状从头组装基因组对于深入理解HLB病原菌泛基因组的重要性。