噬菌体疗法对梨火疫病防控效果及花微生物组的影响研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Impact of phage treatment on fire blight disease outcome and floral microbiome composition

本研究探讨了噬菌体（phage）鸡尾酒疗法对梨火疫病病原体Erwinia amylovora（Ea）的防控效果及其对花微生物组（microbiome）的影响。实验证明，FireFighter噬菌体鸡尾酒能显著降低病害症状（SI指数），且不破坏自然微生物群落结构，反而增加其多样性（Shannon指数和Faith PD）。该研究为噬菌体生物防治的安全性及有效性提供了重要证据，对农业可持续发展具有积极意义。

　　

ABSTRACT

随着替代农药在农业和临床环境中控制细菌病原体的重要性日益增加，使用噬菌体病毒（phages）来减少细菌生长和预防疾病正变得越来越受欢迎。噬菌体在体外以及跨越植物和动物宿主系统中均显示出高效杀灭细菌细胞的能力，尽管在其成功预测性方面仍存在许多问题，尤其是在更真实的生态条件下以及考虑到病原体的自然株系变异时。此外，随着噬菌体应用的日益普遍，我们必须更好地理解这些处理对与宿主相关的微生物群落（即它们的微生物组）的影响。本研究利用一种新开发的靶向火疫病病原体Erwinia amylovora的噬菌体鸡尾酒，既测试了这些噬菌体在接种病原体的梨花中的功效，又探究了这种应用是否对花的固有微生物组产生不利影响。我们发现噬菌体能够大大减少病原体数量和疾病症状，但其应用并未显著改变花微生物组，强调了它们对目标宿主的高度特异性。这些数据支持在该疾病系统中安全有效地使用噬菌体。

IMPORTANCE

迫切需要开发新的策略来控制作物中的细菌性疾病，特别是解决仁果类水果中火疫病的新兴问题。噬菌体作为感染和杀死细菌的病毒，是一种有吸引力的策略。然而，关于这些病毒如何影响自然微生物群落、它们的潜在脱靶效应以及环境安全性的信息很少。本研究解决了这些问题，考察了一种有效的靶向Erwinia amylovora（仁果类水果火疫病的病原体）的噬菌体鸡尾酒的影响。在我们的研究中，我们证明了我们的噬菌体鸡尾酒不影响Bradford梨花的花自然微生物组。我们进一步发现，在存在E. amylovora的情况下，我们的噬菌体鸡尾酒显著增加了微生物群落的丰富度和多样性。我们的数据，连同其他并行进行的研究，为噬菌体应用不太可能对其用于治疗的靶细菌病原体之外产生影响这一观点增添了虽小但不断增长的证据。

INTRODUCTION

Erwinia amylovora是一种臭名昭著的植物病原体，是商业梨园和苹果园中火疫病的病原体。近年来，世界各地都有火疫病爆发的报道，给种植者带来了毁灭性的后果。在韩国，火疫病相对较新（首次报道于2020年），共有744个果园显示出该疾病的迹象。该国先前无疫病地区感染的潜在来源被确定为受感染植物材料的运输，之后疾病通过风、雨和昆虫（包括传粉者）等自然方式传播到邻近果园。后者被认为是E. amylovora的重要载体，因为花是感染建立的关键入口点。一旦细菌到达并开始在花柱头上生长，它们就可以通过花托进入植物组织，从那里它们通过薄壁组织系统移动形成生物膜，破坏植物的表皮，从而使细菌“溢脓”逃离植物组织，形成二次感染源。这种溢脓又可以有效地被作为载体的昆虫传播，将细菌传播到邻近的植物。

E. amylovora是否成功引起火疫病症状取决于病原体、植物以及其所处环境的非生物和生物因素的遗传背景。非生物驱动因素，如湿度和温度，决定了火疫病的发展和整体爆发的严重程度，这使得预测模型的开发成为可能。然而，生物环境，如病原体到达时花的固有微生物群落，也起着至关重要的作用。在健康的花中，微生物组主要由属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的细菌组成，并且在不同的苹果品种中似乎非常相似。当E. amylovora被人工接种到花中时，随着肠杆菌科在微生物群落中变得更占优势，这个群落会发生转变。除了在自然形成疾病结果方面很重要之外，这些生物相互作用可以有效地被利用作为在商业环境中减轻火疫病爆发的策略。特别是，在识别和部署通过生态位竞争或次级/ specialized代谢产物的产生直接与E. amylovora竞争的特定微生物方面已经取得了良好进展。迄今为止，已经鉴定并商业化了几种这样的细菌分离株，其中包括Pantoea sp. CT-1093, Pantoea agglomerans E325 (Bloomtime), Pantoea vagans C9-1 (BlightBan C9-1), Pseudomonas fluorescens A506 (BlightBan A506), 和 Bacillus subtilis QST713 (Serenade)。这种方法也已扩展到疾病保护性真菌，如Aureobasidium pullulans CF10和CF40，以及酵母菌，如Cystofilobasidium infirmominiatum YY6和Cryptococcus neoformans C9和C16，所有这些都减轻了火疫病出现的严重程度。

超越微生物竞争来思考，生物环境也包括病毒，其中许多（噬菌体）能够直接杀死细菌病原体或以改变病原体竞争环境的方式改变固有微生物群落。裂解性噬菌体以株系特异性的方式感染和裂解细菌细胞，并已成功应用于许多植物疾病系统的疾病控制，包括火疫病。在世界范围内，有相当精细的工作来分离、表征和测试不同噬菌体控制火疫病的能力，正如Gayder及其同事所综述的那样。这些努力已经产生了目前可商业获得的几种噬菌体鸡尾酒，尽管受到严格监管，但关于这些应用的环境安全性存在许多问题。重要的是，由于噬菌体宿主范围仍然是一个高度活跃的研究领域，通常不清楚噬菌体应用是否可能对宿主内的固有微生物组产生意外影响。在噬菌体不仅靶向病原体，而且还靶向相关的非致病性细菌株/种的情况下，它们的应用实际上可能从环境中移除/减少重要竞争物种的种群，为病原体的生长和疾病发生铺平道路。因此，不仅测试噬菌体对其靶病原体的影响，而且更好地理解其对更广泛宿主微生物组的影响至关重要。一项专注于商业噬菌体产品（AgriPhage）对存在E. amylovora的苹果花微生物组影响的开创性研究特别证明了噬菌体对微生物群落整体丰富度和组成没有不利影响。

在这项研究中，我们评估了FireFighter噬菌体鸡尾酒在减轻加利福尼亚州伯克利采集的豆梨（Callery pear）花中E. amylovora疾病严重程度方面的潜力。豆梨是一种观赏梨树，种植在许多城市地区，是研究自然火疫病动态的极好系统，因为这些树木尽管有活动性疾病症状，却未接受疾病治疗。我们使用的噬菌体鸡尾酒由四种不同的噬菌体组成（ΦFifi011, ΦFifi44, ΦFifi287, 和 ΦFifi318，GenBank登录号分别为PQ051109, PQ051110, PQ051113, 和 PQ051114），属于不同的分类群。Fifi011和Fifi287都属于Schitoviridae科，分别属于Waedenswilvirus属和Yonginvirus属。基于同源性，Fifi44是Chaseviridae科和Cleopatravirinae亚科的一部分，而Fifi318显示出与FelixO1-like簇的同源性，并且是Ounavirinae科的Kolesnikvirus的一部分。该鸡尾酒在减少由韩国E. amylovora株系感染的树苗的火疫病症状方面是有效的。此外，该鸡尾酒专门设计用于降低不同噬菌体之间交叉耐药的风险。我们确定了这种噬菌体鸡尾酒在控制不同病原体密度下梨花中E. amylovora感染的总体功效，测量了疾病症状和病原体密度的减少。最后，我们通过16S群落测序表征了单一噬菌体和整个鸡尾酒对梨花自然花微生物组的影响，以评估噬菌体应用的潜在安全影响。我们的结果与最近在苹果树上应用的另一种独立的、可商业获得的噬菌体鸡尾酒的结果一致，并强调噬菌体可以在火疫病系统中安全有效地应用。

RESULTS

The FireFighter phage cocktail significantly reduces symptom development as determined in an in vitro blossom assay

花是E. amylovora在春季引发感染和引起火疫病症状的关键入口点。为了量化梨花中的疾病进展，我们采用了一种体外花测定法，使用环境采集的豆梨花来筛选最佳病原体浓度，并建立了一个评分系统来评分疾病严重程度作为症状指数（SI）：花托无可见变色（SI 0）；花托轻微变色并在花中心产生棕色生物膜（SI 1）；花托深色变色，产生生物膜，并且疾病症状扩展到花的其他部分，如雄蕊丝（SI 2）；以及花托、雄蕊丝严重变色，产生生物膜，并且疾病扩展到维管组织（SI 3）。只有一小部分喷洒浓度为10⁵ CFU/mL（10⁵ CFU/花）的花在接种3天后出现疾病症状（5% SI 1, 10.5% SI 2, 和 10.5% SI 3）。将浓度增加到10⁷ CFU/mL导致74%的花出现症状（10.5% SI 1, 10.5% SI 2, 和 53% SI 3），在浓度为10⁹ CFU/mL时，所有花都显示出严重的疾病症状（5% SI 2 和 95% SI 3）。

利用这些结果，我们评估了FireFighter噬菌体鸡尾酒在减少梨花疾病方面的潜力。因此，在接种浓度为10⁷ CFU/mL的E. amylovora之前，用最终浓度为10⁸ PFU/mL的噬菌体鸡尾酒喷洒花朵。如图所示（面板A和B），未经处理的花蕾出现了严重的疾病症状，与用FireFighter噬菌体鸡尾酒处理的花蕾形成鲜明对比（Wilcoxon检验，经多重比较校正，P值 < 0.001）。我们未发现花朵采集地点对疾病严重程度有显著影响（Wilcoxon检验，P值 = 0.5356）。未接种的花蕾与细菌接种前用噬菌体处理的花蕾之间未观察到显著差异，表明噬菌体鸡尾酒强烈减少了花朵中的症状发展。

Non-symptomatic blossoms harbor increased diversity in community composition in the presence of E. amylovora after phage treatment

接下来，我们评估了外部接种E. amylovora后微生物群落的多样性和群落组成，并在不同处理之间进行了比较。在这里，我们选择评估无症状花而不是有症状花，因为后者的群落 heavily dominated by E. amylovora。我们观察到基于香农指数（Kruskal-Wallis检验，P值 = 0.01）和Faith PD（P值 = 0.017），噬菌体/细菌处理对微生物群落丰富度有显著的总体影响。更仔细地比较不同处理，我们观察到接种Ea的花蕾与在没有Ea的情况下用噬菌体鸡尾酒处理的花蕾以及在缓冲液条件下相比，α多样性显著降低（经多重比较校正的Kruskal-Wallis检验，Pielou均匀度P值0.025，Faith PD P值0.025，香农P值0.003）。基于香农指数和Faith PD指标，在存在Ea的情况下用FireFighter噬菌体鸡尾酒处理花蕾，与单独使用Ea的花相比，显著增加了α多样性（经多重比较校正的Kruskal-Wallis检验，Ea vs Ea-鸡尾酒，P值分别为0.025和0.05）。连同在没有Ea的情况下接种鸡尾酒后群落丰富度的显著增加（经多重比较校正的Kruskal-Wallis检验，水 vs 鸡尾酒，Faith PD P值0.01），这些结果表明，尽管存在病原体，该鸡尾酒增加了花微生物组的整体多样性。

在不同处理中，我们还发现通过β多样性（Bray-Curtis相异度）测量的群落组成在组间发生了显著变化（PERMANOVA P值 = 0.001）。更具体地说，我们基于β多样性区分了三个显著性水平：A组包括用水和在没有Ea的情况下用噬菌体鸡尾酒处理的花蕾，B组包括在存在Ea的情况下用噬菌体鸡尾酒处理的花，C组包括在不存在噬菌体的情况下接种Ea的花（经多重比较校正的Pairwise PERMANOVA，P值 < 0.05），这在相对丰度图中进一步说明。当外部接种E. amylovora时，它成为微生物群落中的优势成员。相反，没有外部接种E. amylovora时，假单胞菌目（Pseudomonadales）和伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）是豆梨花微生物组中最丰富的成员。基于靶向E. amylovora的定量PCR（qPCR），我们发现外部接种E. amylovora有显著影响（ANOVA，P值 < 0.001），但我们无法识别处理和未处理花蕾之间E. amylovora浓度的显著差异（Tukey检验，经多重比较校正，P值 > 0.05）。

The FireFighter phage cocktail does not impact overall abundance, richness, or community composition of the floral microbiome

为了评估噬菌体鸡尾酒的安全性，我们评估了其对自然花微生物组的影响。因此，我们测定了自然微生物群落的每花CFU数，以及使用qPCR测定了花中E. amylovora的浓度。在采集花朵的不同树木中，我们观察到总细菌浓度在10⁵到10⁷ CFU/花之间变化。使用线性混合效应模型 followed by ANOVA，我们无法区分处理、树木或交互项（树木 × 处理）对模型的显著影响。基于qPCR，噬菌体处理后花中E. amylovora DNA的浓度相对较高，这很可能是因为噬菌体裂解液中存在E. amylovora DNA，正如在没有外部接种E. amylovora时观察到的那样。在没有外部接种E. amylovora或噬菌体悬浮液的情况下，没有检测到E. amylovora的拷贝（拷贝数降至检测限以下）。

接下来，我们评估了噬菌体应用对花微生物组整体丰富度和群落组成的影响。在不同处理中，我们发现FireFighter噬菌体鸡尾酒 nor 该鸡尾酒中的单一噬菌体（Fifi44）对群落的α多样性（香农和Pielou均匀度）没有显著影响。基于Faith PD指标，我们观察到应用FireFighter噬菌体鸡尾酒后丰富度显著增加（经多重比较校正的Kruskal-Wallis检验，P值 < 0.05）。我们没有观察到β多样性的任何显著变化（PERMANOVA，P值 = 0.536）。更仔细地观察不同的分类群，豆梨花微生物组中最主要的成员是假单胞菌目（Pseudomonadales），其次是伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）和微球菌目（Micrococcales）。

DISCUSSION

由E. amylovora引起的火疫病对全球苹果和梨生产构成威胁。近年来，该疾病已传播到世界新的地区，给当地农业社区和特定地区水果的普遍供应带来问题。特别是，韩国最近爆发的火疫病截至2020年已影响超过744个商业果园。这导致迫切需要疾病控制机制，包括使用噬菌体。与任何其他细菌性疾病一样，火疫病可以被认为是微生物群落的生态失调，其中病原体E. amylovora成为该群落的优势成员。最近对与火疫病相关的苹果花微生物组的洞察显示，在健康的花中，微生物组主要由Pantoea spp. 和 Lorielloppsis cavernicola主导。相反，生态失调的群落主要由Pseudomonas spp., Salmonella spp., 和 Erwinia spp.组成，其中E. amylovora丰度很高。此外，火疫病的特征是α多样性（香农多样性指数和Pielou均匀度）显著降低，同时β多样性（Bray-Curtis）发生转变。与此一致，我们的离体系统证实，外部接种E. amylovora到自然采集的豆梨花显著降低了花微生物组的α多样性，并且我们计算了无症状花朵中群落组成的显著变化，正如Cui及其同事在田间研究中所描述的那样。因此，我们认为我们的离体花测定是评估生物控制剂（如噬菌体）对疾病进展以及自然花微生物组影响的一个有价值的工具。

在我们的研究中，我们考察了FireFighter噬菌体鸡尾酒在控制梨花中E. amylovora的功效，以及其对整体微生物群落的影响，以评估噬菌体鸡尾酒的安全性。我们表明，在相对较高的病原体压力下，噬菌体鸡尾酒能够在体外显著改善花的健康状况。这些结果强调了该鸡尾酒作为在开花期间减轻火疫病的有效生物控制工具的潜力，正如Gayder及其同事最近总结的那样。由于E. amylovora噬菌体的功效受到细胞外聚合物产生的影响，未来的研究应该考察该噬菌体鸡尾酒在控制高amylovoran产生E. amylovora分离株方面的性能。

我们进一步评估了这种鸡尾酒在存在和不存在病原体的情况下对更大微生物群落的影响。因此，我们证明了尽管存在病原体，噬菌体应用部分恢复了花微生物组的丰富度和群落组成，从而减轻了由E. amylovora引起的生态失调。当接种了Xanthomonas campestris pv. campestris的微观世界，并评估了两种作为生物控制候选噬菌体对土壤微生物组的影响时，也观察到了类似的现象。虽然发现噬菌体减少了土壤样品中的宿主生物量，但它们对土壤微生物组的丰富度和组成影响最小。关于噬菌体对植物相关微生物群落影响的新兴研究表明，在温室条件下，噬菌体应用后，番茄根际微生物群的α多样性没有显著变化。类似地，在受控环境以及田间条件下应用Xanthomonas campestris pv. campestris噬菌体后，未检测到对土壤微生物组α或β多样性的显著影响。这些结果进一步被Gdanetz及其同事证实，因为他们描述了在主要应用AgriPhage后Erwinia丰度的减少，而对苹果的微生物群落没有任何进一步的影响。

噬菌体应用中的一个重要开放问题是其整体安全性以及对微生物群落其他成员的脱靶效应，这在多噬菌体鸡尾酒的情况下可能特别重要。为此，我们评估了FireFighter噬菌体鸡尾酒中的单一成员与一个由五个成员组成的多样化噬菌体鸡尾酒在不存在宿主的情况下对豆梨自然花微生物组的影响。我们的结果表明，噬菌体对微生物群落可培养部分的总丰度，以及整个花微生物组的丰富度和组成的影响极小。此外，尽管使用的噬菌体种类多样，但单一噬菌体和噬菌体鸡尾酒对非目标微生物群落没有差异。有趣的是，α多样性指标（Faith's PD，这是基于所有扩增子序列变体（ASVs）生成的分类学树的分支长度计算的）有显著增加。这支持了噬菌体鸡尾酒可能增加微生物群落分类学丰富度的假设，正如先前在番茄植物中进行的全病毒移植所观察到的那样。类似的结果也在一项关于单一噬菌体KMM4对Aurelia aurita微生物组影响的研究中被描述，尽管同一研究中的其他噬菌体被发现对丰富度有负面影响，包括一个由四种噬菌体（包括KMM4）组成的鸡尾酒。虽然我们的研究表明基于通用细菌标记（16S），噬菌体对豆梨花微生物组的影响极小，但我们预测噬菌体对微生物组功能影响的能力有限。未来，采用宏基因组学的研究可能会更好地阐明噬菌体是否存在株系水平的影响，和/或噬菌体的存在是否改变了特定基因的存在/缺失。

Conclusion

随着在农业中寻找替代疾病控制策略的需求日益增加，噬菌体的应用正迅速普及。在这里，我们扩展了最近的工作，表明单一噬菌体和多样化的五噬菌体鸡尾酒各自都能大大减少接种了E. amylovora的梨花中火疫病的疾病症状，而不改变花的固有微生物组。观察到的脱靶效应的缺乏，以及一些噬菌体存在下微生物组多样性增加的证据，表明在这种情况下噬菌体应用不太可能减少植物中可能也在防止病原体建立的其他细菌竞争效应。我们还表明，离体花测定作为测量噬菌体疾病控制的半自然环境显示出巨大的前景。结合最近在美国对一种商业噬菌体鸡尾酒在苹果上进行的田间试验，我们的数据为这一虽小但不断增长的证据增添了内容，即 deliberate 和 well-defined 的噬菌体应用不太可能对其用于治疗的靶细菌病原体之外产生影响。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial and bacteriophage manipulations

从加利福尼亚州伯克利的豆梨中分离出E. amylovora分离株T8，用于噬菌体增殖和接种测定。细菌在King's Broth (KB)中于28°C、150 rpm摇床培养，或在KB琼脂平板上培养。本研究使用了四种噬菌体：Fifi011, Fifi44, Fifi287, 和 Fifi318。每种噬菌体分别用E. amylovora T8株系在28°C的液体KB培养基中增殖24小时，通过以0.1的感染复数接种指数生长期的培养物（光密度为0.3）。在4°C下以6,000 × g离心20分钟后，上清液通过0.22 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）注射器过滤器（Millipore, Bedford, MA, USA）过滤，以去除细菌细胞和其他碎片。使用100 kD离心过滤装置（Millipore, Amicon Ultra Centrifugal Filters）浓缩噬菌体裂解液，并用氯化钠-硫酸镁（SM）缓冲液（50 mM/L Tris-HCl, 100 mM NaCl, 和 10 mM MgSO₄；pH 7.5）重悬。将噬菌体裂解液（通过在Ea T8上的噬斑测定确定为10¹⁰ PFU/mL）储存于4°C以备后续使用。每种噬菌体在无菌水中稀释至约0.25 × 10⁸ PFU/mL，然后合并至最终浓度为10⁸ PFU/mL，再喷洒到梨花上。

Efficacy of the phage cocktail to reduce symptom development in Callery pear blossoms and effect of phages on the microbial community after inoculation of E. amylovora

在2023年2月，从加利福尼亚州伯克利不同地理位置的六棵树上采集开花后1天的年轻豆梨花（刚过爆米花阶段、雄蕊呈粉红色的花）。采集后，将花（每板10朵）放入深孔水琼脂板（mQ补充10 g/L琼脂）中。根据条件，首先使用无菌聚丙烯指尖泵喷雾器（The Cary Company，零件号30WP24，用铝箔包裹灭菌）将含有Fifi44或整个噬菌体鸡尾酒的噬菌体悬浮液（在无菌水中稀释至10⁸ PFU/mL，每板10 mL）或作为对照的无菌水喷洒到花上（每种条件六个板，从6棵树采集的花，每棵树10朵花）。将生长在KB琼脂平板上的E. amylovora T8重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备细菌接种物，并在PBS中稀释至最终浓度为10⁵、10⁷和10⁹ CFU/mL，然后喷洒到花上（每10朵花使用无菌手动喷雾器喷洒10 mL每板）。在阴性对照的情况下，将PBS喷洒到花上。用Parafilm密封板以保持高湿度，并在28°C下培养3-4天。收集无症状花蕾（每种条件下跨越六棵树的n = 6），并使用无菌研杵在PBS中匀浆。使用Qiagen PowerSoil Pro试剂盒根据制造商指南从匀浆花（500 μL）中提取DNA。

Evaluating the effect of the phage cocktail on the natural microbial community in Callery pear blossoms

通过在不存在外部接种E. amylovora的情况下喷洒豆梨花（n = 10，刚过爆米花阶段）来评估噬菌体鸡尾酒对自然微生物群落的影响，这些花从加利福尼亚州伯克利的六棵树上采集并称重。将花放入深孔水琼脂板中（n = 10/板），并使用无菌聚丙烯指尖泵喷雾器喷洒Fifi44、鸡尾酒（Fifi011, Fifi44, Fifi287, 和 Fifi318）或无菌水（每板10 mL）。将花根据采集的树汇集，悬浮在磷酸盐-甘油缓冲液（0.03M NaH₂PO₄, 0.07 M Na₂HPO₄·7H₂O, 1:10 vol% 甘油）中，并使用无菌研杵匀浆。将稀释系列铺在KB琼脂平板上并培养48小时，以获得细菌群落可培养部分的总浓度。使用Qiagen PowerSoil Pro试剂盒从汇集的花匀浆（500 μL）中提取DNA，如制造商所述。

DNA extraction and 16S community sequencing

使用Qubit dsDNA HS Assay试剂盒定量DNA浓度。根据Meyer及其同事的方法，对16S rRNA基因的V5–V7区域进行了测序。简而言之，使用799F (5′–AACMGGATTAGATACCCKG–3′) 和 1193R (5′–ACGTCATCCCCACCTTCC–3′) 引物扩增V5–V7区域，以尽可能排除叶绿体和线粒体污染。将扩增子稀释8:1，并额外扩增9个循环以添加样品特异性条形码，随后进行Qubit定量、合并，并在MiSeq（双端300）平台上进行测序。

qPCR detection of E. amylovora

使用引物hpEaF (5′-CCGTGGAGACCGATCTTTTA-3′) 和 hpEaR (5′-AAGTTTCTCCGCCCTACGAT-3′; Integrated DNA Technologies) 通过qPCR定量花匀浆中E. amylovora的DNA浓度，以三重复进行，靶向AMY1267基因。反应在Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System上运行，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mix。每个25 μL反应包含12.5 μL SYBR Master Mix, 0.3 μM每种引物, 10 nM ROX参考染料, 2.5 μL DNA模板, 和 8.95 μL UltraPure Nuclease-Free Water。热循环包括95°C初始变性10分钟，随后进行40个循环的95°C 15秒和60°C 60秒。在每个板上运行标准品，使用E. amylovora T8过夜培养物的8个1:10系列稀释点。将稀释液铺在KB琼脂上以确定CFU每毫升，并使用来自三重复反应的平均循环阈值（Ct）值生成标准曲线（R2 ≥ 0.998），这使我们能够计算CFU每毫升并根据在1 mL无菌缓冲液中匀浆的花数量进行标准化。每个花匀浆样品以三重复运行，并使用标准曲线根据Ct值计算CFU每毫升。

Bioinformatic and statistical analysis

通过QIIME2流程分析16S rRNA扩增子。使用Deblur处理读数，修剪至150 bp长度并进行质量过滤。从数据集中去除嵌合读数。使用classify-skylearn函数和SILVA (v138) SSURef NR99全长序列数据库确定序列的分类学。