Rag GTPase异源二聚体全局构象调控真核生物氨基酸感知的分子机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Global conformation of the Rag GTPase heterodimer governs eukaryotic amino acid sensing

本研究发现Rag GTPase异源二聚体的全局构象（而非局部核苷酸结合）是氨基酸感知的关键检查点。通过单分子FRET技术，作者揭示了核苷酸结合、突变和mTORC1相互作用如何动态调控二聚体构象，并鉴定出保守脯氨酸残基作为构象变化的"分子铰链"。该工作为理解真核细胞营养感知机制提供了新范式，对相关疾病治疗具有重要启示。

　　

Rag GTPase异源二聚体的结构与功能

作为真核细胞氨基酸感知的核心介质，Rag GTPase异源二聚体在营养充足时通过结合mTORC1复合物激活细胞生长程序。与单体GTPase不同，该二聚体具有独特的架构：RagA/B与RagC/D亚基各含核苷酸结合结构域（NBD）和介导二聚化的C端Roadblock结构域（CRD）。当RagA/B结合GTP而RagC/D结合GDP时，二聚体呈现激活状态，强力招募mTORC1至溶酶体膜。

建立单分子FRET检测体系

为可视化二聚体动态构象，研究者开发了"半胱氨酸精简"（cyslite）版本Rag GTPase，通过定点突变实现特异性荧光标记。实验证实该构建体在核苷酸结合亲和力（K_d）、GTP水解速率及GATOR1调控等方面与野生型无异，且能恢复基因敲除细胞的氨基酸响应能力。采用交替激光激发（ALEX）技术，通过FRET效率（E）和化学计量数（S）双参数分析，精准捕捉单个蛋白分子的构态变化。

核苷酸调控的全局构象变化

在无核苷酸（apo）状态下，二聚体呈现以低FRET（~0.13）为主的开放构象，爆发方差分析（BVA）显示高FRET态存在快速动态转换。双GDP结合使构象趋于稳定，出现中FRET（~0.35）群体，隐马尔可夫模型（HMM）揭示其作为低-高FRET转换的中间态。单GTP结合（RagA^GTP-RagC^GDP）引发显著构象紧缩，高FRET（~0.6）成为主导态，对应NBD间距离缩短至51?的闭合构象。对照实验证实CRD标记的FRET信号无变化，验证了NBD特异性运动。

双GTP加载引发的亚基通讯

饱和GTP条件下，中FRET群体增加且动态性显著增强，提示双GTP结合触发亚基间解耦机制。非水解型GTP类似物GppNHp（过渡态类似物）诱导构象开放，而GDP·AlF_X（水解过渡态类似物）稳定中低FRET态，表明GTP水解进程与构象变化耦合。该发现与生化研究相互印证：第二分子GTP结合会激发"分子间对话"，通过促进后结合GTP的水解恢复单GTP加载状态。

关键突变体的构象调控机制

RagC(S75N)突变在双GDP状态下即增强中高FRET群体，预示其易形成利于mTORC1结合的预激活构象。相反，RagA(T21N)突变使二聚体在所有核苷酸状态下均维持开放构象，导致信号传导失活。更重要的是，在连接NBD与CRD的铰链区发现保守脯氨酸残基（RagA-Pro182/RagC-Pro238），其甘氨酸突变（P182G/P238G）虽不影响局部核苷酸结合功能，但特异性破坏GTP诱导的构象锁定，使高FRET态分布展宽且动态性增加。

mTORC1招募过程中的构象重排

通过凝胶过滤分离Raptor结合与游离的Rag二聚体，发现Raptor结合使高FRET态向中FRET态（~0.4）转化，对应晶体结构中"爪状"插入的开放构象。这表明激活态二聚体先以闭合构象招募mTORC1，随后通过构象调整形成稳定复合物，存在"相遇复合物"中间态。

生理功能验证与动力学分析

细胞实验中，铰链突变体引起mTORC1信号异常激活，免疫共沉淀显示其与mTORC1结合增强。动力学监测进一步揭示突变体加速氨基酸刺激响应速率，但不影响失活过程。证明全局构象调控是氨基酸信号传导的独立检查点。

研究意义与展望

该工作突破传统GTPase局部构象研究的局限，确立二聚体全局构象在营养感知中的核心地位。发现的脯氨酸铰链为相关疾病治疗提供新靶点，而构象动态监测方法为研究复杂蛋白机器工作机制开辟了新途径。