多组学引导的水凝胶设计：通过调控IL-6减轻内质网应激以促进骨再生

《Bioactive Materials》：Multi-omics-informed hydrogel design: modulating IL-6 to reduce endoplasmic reticulum stress in bone regeneration

本研究针对不同部位骨缺损愈合异质性的难题，通过多组学技术揭示了肺泡骨快速愈合的关键机制——M2巨噬细胞高表达IL-6可通过调控HSPA5缓解ERS相关凋亡。基于此，研究人员开发了负载IL-6的GelMA水凝胶，成功应用于股骨缺损模型，显著促进了骨再生。该研究为基于生物学机制的功能性骨修复材料设计提供了新策略。

　　

骨骼损伤是全球性的健康挑战，虽然骨骼具有自我修复能力，但修复过程受到缺损大小、位置、年龄和系统性疾病等多种因素影响，导致愈合效果存在显著差异。一个有趣的现象是，不同解剖部位的骨骼愈合速度并不相同，例如，牙槽骨（肺泡骨）缺损的愈合速度明显快于股骨缺损。这种部位特异性的愈合差异提示我们，背后可能隐藏着独特的调控机制。理解这些机制，对于设计能够有效增强骨再生的功能性生物材料至关重要。

然而，在骨缺损的早期修复阶段，当血管网络尚未完全建立，机械刺激也并非最佳时，其具体的修复机制仍然不甚明了。特别是，为何肺泡骨能够实现快速愈合，而股骨修复相对缓慢，这一问题的答案对于开发新型骨修复策略具有重要的指导意义。

为了解开这个谜团，发表在《Bioactive Materials》上的一项研究，采用了一种创新的“多组学引导的材料设计”策略。研究人员通过整合转录组学、蛋白质组学和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，深入探究了肺泡骨和股骨在损伤早期修复过程中的细胞动态和分子机制。

研究发现，在股骨缺损的早期，存在着广泛的内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）和随之而来的细胞凋亡，这可能是阻碍其快速修复的关键因素。其中，热休克蛋白家族A成员5（Heat Shock Protein Family A Member 5, HSPA5）的表达上调是诱导ERS的核心。相反，在肺泡骨缺损的早期，研究者观察到了一群独特的、高表达白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）的M2型巨噬细胞（记为IL-6⁺ M2）。这群细胞分泌的IL-6能够有效抑制HSPA5的表达，从而减轻ERS和细胞凋亡，为肺泡骨的快速修复创造了有利的微环境。

更深入的分析揭示，在肺泡骨早期修复过程中，一群表达Formin Homology 2 Domain Containing 3（FHOD3）的中性粒细胞（记为Fhod3⁺ Neutrophil）可能作为上游调控细胞，影响着IL-6⁺ M2巨噬细胞的功能。

基于这些关键的生物学发现，研究人员进一步进行了材料设计。他们制备了甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl, GelMA）多孔水凝胶，并将其作为IL-6的局部递送载体（记为GelMA^IL-6）。当将这种功能化水凝胶应用于大鼠股骨缺损模型时，它成功模拟了肺泡骨中高浓度IL-6的修复环境。实验结果表明，GelMA^IL-6水凝胶能够显著促进股骨缺损的新骨形成，其作用机制正是通过调节ERS和相关的凋亡过程来实现的。

这项研究的意义在于，它不仅仅揭示了骨再生部位差异的新机制，更重要的是，它展示了一条从基础生物学发现到功能性生物材料设计的完整路径。通过多组学分析识别出关键的生物活性因子（IL-6），进而指导智能生物材料（IL-6负载水凝胶）的构建，最终实现精准增强组织再生的目的。这种研究范式为未来开发治疗各种组织缺损的个性化再生医学策略提供了新的思路和强有力的实验依据。

主要技术方法概览

本研究综合运用了多种前沿技术。在动物模型方面，建立了大鼠肺泡骨（拔牙模型）和股骨缺损模型。组织学分析包括苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）等。微观结构评估采用微型电子计算机断层扫描（μCT）。分子机制探索则整合了批量RNA测序（Bulk RNA-seq）、蛋白质鉴定（质谱法）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及蛋白质印迹（Western Blot）等技术。此外，还合成了负载IL-6的GelMA水凝胶，并对其物理性质、IL-6释放动力学及生物相容性进行了表征。

研究结果

1. 肺泡骨与股骨早期修复过程的比较分析

通过组织学染色和μCT分析，研究人员发现肺泡骨缺损的修复进程显著快于股骨缺损。在损伤后第4天，肺泡骨缺损处已出现密集的胶原纤维样组织和大量淋巴细胞浸润，而股骨缺损处则仍以血细胞为主，仅有少量胶原纤维出现。到第13天，肺泡骨已呈现致密的骨化，而股骨仅出现小片状的类骨质。成骨标志物Runx2和Osterix的表达在肺泡骨中也更早、更强烈。这些结果表明，骨再生的部位差异性在损伤早期（尤其是第4天）就已显现。

2. 批量RNA-seq与蛋白质鉴定识别早期修复关键信号

对损伤后第4天的修复组织进行批量RNA-seq和蛋白质组学分析。结果显示，股骨缺损早期显著富集于ERS、蛋白质磷酸化、凋亡正调控等通路，关键基因为Hspa5。相反，肺泡骨缺损早期则富集于凋亡负调控、IL-6产生正调控等通路，关键基因为Il-6。免疫组化验证证实，股骨中HSPA5蛋白高表达，而肺泡骨中IL-6蛋白高表达。

3. 单细胞图谱揭示修复早期细胞异质性

通过对第4天修复组织进行scRNA-seq，构建了包含15个主要细胞类型的图谱。分析发现，肺泡骨和股骨缺损早期的细胞组成存在显著差异。基因表达定位显示，Il-6基因主要在肺泡骨的M2巨噬细胞中高表达，而Hspa5则在多种细胞中广泛表达。细胞通讯分析揭示了不同细胞类型间复杂的相互作用网络。

4. IL-6在肺泡骨修复早期调控HSPA5

伪时间轨迹分析表明，在肺泡骨修复过程中，Il-6的表达随着时间推移迅速上升，同时伴随着Hspa5的下调。体内抑制剂实验进一步验证了这一调控关系：使用IL-6抑制剂LMT28处理肺泡骨缺损后，IL-6表达被抑制，而HSPA5表达显著上升；使用HSPA5抑制剂HA15处理股骨缺损后，HSPA5被抑制，但IL-6表达未见显著变化。这表明IL-6对HSPA5具有上位性调控作用。

5. M2巨噬细胞是肺泡骨中IL-6的主要来源

对表达Il-6的细胞进行亚群细分，发现了一个独特的IL-6⁺ M2巨噬细胞亚群。多重免疫荧光染色显示，在肺泡骨缺损中，IL-6蛋白信号与M2巨噬细胞标志物ARG1信号相邻，证实了IL-6由M2巨噬细胞分泌。此外，研究还发现了一个在肺泡骨中特异性富集的Fhod3⁺中性粒细胞亚群，其与IL-6⁺ M2巨噬细胞存在密切的相互作用，可能是上游调控细胞。

6. IL-6通过抑制HSPA5减轻ERS及相关凋亡

研究发现，股骨缺损早期表现出强烈的ERS反应，其标志性蛋白（如p-IRE1α, p-PERK, ATF6）和凋亡相关蛋白（CHOP, Caspase-12）表达量高，同时活性氧（ROS）和钙离子（Ca²⁺）水平也较高。而肺泡骨缺损中这些指标均显著较低。隧道实验（TUNEL）证实股骨缺损早期凋亡细胞更多。抑制剂实验表明，抑制IL-6会加剧肺泡骨的ERS和凋亡，而抑制HSPA5则可缓解股骨的ERS和凋亡。这证明IL-6通过下调HSPA5来维持ERS稳态，抑制过度凋亡。

7. 负载IL-6的GelMA水凝胶促进股骨缺损修复

研究人员成功制备了可注射、光交联的GelMA^IL-6水凝胶。该水凝胶能持续释放IL-6，在96小时内释放浓度达到约410 pg/mL，与在肺泡骨缺损中测得的生理浓度相近。将GelMA^IL-6应用于大鼠股骨缺损后，μCT和组织学分析显示，与空白对照组和单纯GelMA组相比，GelMA^IL-6治疗组的新骨形成显著增加，骨矿物密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）均提高，而小梁间距（Tb.Sp）降低。

8. GelMA^IL-6水凝胶通过调节ERS和凋亡发挥作用

对治疗后的股骨组织进行分子机制验证发现，GelMA^IL-6水凝胶局部释放的IL-6能够显著下调ERS相关蛋白（p-IRE1α, p-PERK）和凋亡蛋白（Caspase-12）的表达，同时降低组织中的ROS水平。隧道实验也显示凋亡细胞数量减少。这表明，外源性补充IL-6成功地模拟了肺泡骨的快速修复机制，通过调节ERS和凋亡通路促进了股骨愈合。

结论与展望

本研究系统地阐明了肺泡骨相较于股骨能够快速再生的关键机制。其核心在于肺泡骨缺损早期微环境中，由Fhod3⁺中性粒细胞调控的IL-6⁺ M2巨噬细胞能够分泌高水平的IL-6，进而抑制HSPA5蛋白的表达，有效缓解了过度的内质网应激及其引发的细胞凋亡，为骨再生创造了稳定的微环境。相反，股骨缺损早期缺乏足够的IL-6调控，导致HSPA5高表达，引发“ERS风暴”和细胞凋亡，延缓了修复进程。

研究的创新性不仅在于揭示了骨再生部位差异性的新机制，更在于成功实践了“多组学引导的生物材料设计”这一范式。通过整合多组学数据识别出关键生物活性因子IL-6，进而设计并验证了能局部递送IL-6的GelMA水凝胶，成功地将肺泡骨的“快速愈合”特性赋予了股骨。这为开发基于特定生物学机制、具有精准调控功能的智能骨修复材料提供了坚实的理论基础和可行的技术方案。

未来研究可进一步利用基因编辑动物模型、空间转录组学等技术深入验证IL-6⁺ M2巨噬细胞和Fhod3⁺中性粒细胞的具体功能及其调控网络。同时，探索将IL-6或其他ERS调节因子与可降解金属植入体等临床常用骨修复材料相结合，有望为临床难治性骨缺损的治疗开辟新的途径。