水凝胶递送抗纤维化剂与纳米声敏剂增强声动力疗法治疗骨肉瘤疗效

《Bioactive Materials》：Hydrogel delivering antifibrotic agent and nano-sonosensitizer enhances efficacy of sonodynamic therapy in osteosarcoma treatment

本研究针对骨肉瘤（OS）肿瘤微环境（TME）中缺氧、高谷胱甘肽（GSH）及癌症相关成纤维细胞（CAFs）致密细胞外基质（ECM）限制声动力疗法（SDT）疗效的难题，开发了一种共载纳米声敏剂PCN-224@MnO2@HA（PMH）和SMAD3抑制剂SIS3的水凝胶局部递送平台。研究证实，该策略通过MnO2催化内源性H2O2产氧并消耗GSH以增强SDT过程中的活性氧（ROS）生成，同时SIS3通过阻断TGF-β/SMAD3信号通路重编程CAFs、减少胶原沉积，在小鼠模型中联合治疗使肿瘤生长抑制率达76%，并触发强效抗肿瘤免疫应答，为实体瘤治疗提供了新范式。

　　

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的恶性骨肿瘤之一。尽管保肢手术联合全身化疗已成为标准治疗方案，但局部复发风险高，且复发患者预后极差，转移和死亡率显著升高。这些临床挑战凸显了当前治疗手段的局限性，迫切需要能够更有效靶向残留病灶的新策略。在此背景下，声动力疗法（SDT）因其组织穿透深度大、能诱导活性氧（ROS）介导的肿瘤细胞死亡而成为一种有前景的治疗方式。SDT过程中产生的ROS会导致细胞器不可逆损伤，最终诱发免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD伴随损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，从而通过促进抗原呈递细胞成熟来启动抗肿瘤免疫。然而，骨肉瘤复杂的肿瘤微环境（TME）对SDT疗效构成了显著障碍。

骨肉瘤的特征是由恶性细胞、基质细胞和致密的细胞外基质（ECM）组成的纤维增生性TME。在细胞层面，低氧含量和升高的谷胱甘肽（GSH）是SDT的主要障碍：缺氧限制ROS产生，而GSH作为关键的细胞内抗氧化剂，会清除ROS并进一步削弱治疗效果。在基质层面，TME内的肿瘤衍生因子（如TGF-β）驱动成纤维细胞活化成为癌症相关成纤维细胞（CAFs）。CAFs产生的胶原和纤连蛋白沉积增加了基质硬度和间质流体压力，形成了物理屏障，限制了ICD诱导的免疫细胞浸润。骨肉瘤的这些生化和结构特征限制了SDT的疗效。因此，同时靶向肿瘤内在耐药机制和细胞外基质屏障的策略，可能增强ROS积累，促进免疫细胞浸润，并最终改善治疗结果。

为了应对这些挑战，本研究引入了一种协同疗法，整合了基于金属有机框架（MOF）的纳米声敏剂（PCN-224@MnO₂@HA，记为PMH）和抗纤维化剂SIS3。为确保局部递送，PMH和SIS3被包裹在由羧甲基壳聚糖（CMCS）和氧化葡聚糖（ODEX）交联形成的水凝胶中。该水凝胶因其化学交联稳定性、机械强度、生物相容性以及优异的载药和缓释能力而被选中。在超声波（US）照射下，PMH通过MnO₂产生氧气并消耗GSH来增强SDT，从而促进ROS积累。同时，SIS3通过抑制TGF-β/SMAD3信号通路重编程CAFs，减少ECM沉积并缓解ECM硬度。在骨肉瘤小鼠模型中，PMH介导的SDT与SIS3诱导的CAF重编程相结合，使胶原沉积减少了约50%，并引发了强劲的抗肿瘤免疫反应，共同促使肿瘤生长抑制率达到76%。这项研究展示了一种新颖的靶向CAF的SDT策略，整合了ECM重塑、ROS增强和局部递送，为实体瘤治疗提供了一个有前景的治疗范例。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：纳米材料合成与表征（包括PCN-224、PM、PMH的合成及TEM、DLS、XRD、XPS等表征）、细胞培养与模型构建（包括人/鼠骨肉瘤细胞系、CAFs诱导模型、3D肿瘤球体模型）、体外生物学功能评估（如CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡/ROS/免疫细胞表型、Western blotting检测蛋白表达、免疫荧光染色、Transwell/伤口愈合实验检测细胞迁移）、水凝胶制备与药物释放动力学研究、以及小鼠骨肉瘤模型（模拟术后残留）的建立及体内治疗疗效和免疫应答评估（包括肿瘤体积监测、组织切片染色、流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞等）。临床样本分析涉及5例骨肉瘤患者组织的Masson染色，生物信息学分析利用了TCGA和GTEx数据库数据。

3.1. 临床样本和数据库证实骨肉瘤存在纤维化微环境

通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析发现，癌症相关成纤维细胞（CAFs）标志基因FAP在多数实体瘤中表达显著高于正常组织。对5例临床骨肉瘤样本的Masson染色显示存在丰富的蓝色胶原沉积，表明肿瘤内存在显著的ECM沉积和CAFs活化。生物信息学分析进一步显示，FAP和COL1A1（编码I型胶原）基因的表达与骨肉瘤组织中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的浸润呈负相关。生存分析提示较高的COL1A1表达有导致患者总生存期和无病生存期变差的趋势。这些结果表明，CAFs的活化和胶原的广泛沉积可能造成了限制SDT诱导的抗肿瘤免疫效力的恶劣TME。

3.2. SIS3诱导的CAFs重编程

研究通过用骨肉瘤条件培养基孵育成纤维细胞NIH3T3在体外成功诱导了CAFs，表现为FAP和α-SMA蛋白表达上调。使用SIS3（一种SMAD3抑制剂）处理后，CAFs标志物表达显著降低，回复到接近静息状态。机制上，SIS3有效抑制了由骨肉瘤条件培养基诱导的SMAD3磷酸化，阻断了TGF-β/SMAD3信号通路。功能实验表明，SIS3处理减弱了CAFs对I型胶原凝胶的收缩能力，并抑制了CAFs的迁移和侵袭能力，但不影响其活力。这些结果提示SIS3可通过阻断TGF-β/SMAD3信号通路抑制CAFs产生致密ECM的能力，从而增强肿瘤治疗效果。

3.3. PCN-224@MnO₂@HA（PMH）的合成及其SDT性能

研究成功合成了以金属有机框架PCN-224为核心，表面依次包裹MnO₂（形成PM）和透明质酸（HA，形成PMH）的纳米声敏剂。表征证实了PMH的成功构建及其良好的稳定性。功能实验表明，PMH能够催化分解H₂O₂产生O₂，消耗GSH，并能通过类芬顿反应产生羟基自由基（·OH）。在超声波照射下，PMH在存在H₂O₂的条件下能有效产生单线态氧（¹O₂）。此外，在3D肿瘤球体模型中，SIS3处理促进了PMH更深入地渗透到球体内部，为有效诱导ICD提供了支持。

3.4. PMH介导的SDT在体外的抗肿瘤效果

细胞实验表明，PMH能被骨肉瘤细胞有效摄取。PMH本身对骨肉瘤细胞显示出一定的毒性，尤其在长时间孵育后，这种毒性可能源于Mn²⁺介导的类芬顿反应产生·OH。当与超声波联合应用时，PMH+US处理能诱导骨肉瘤细胞内产生大量ROS，导致显著的细胞死亡和凋亡。相比之下，对正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒性较低。这表明PMH介导的SDT能特异性且有效地杀伤骨肉瘤细胞。

3.5. SDT诱导的ICD和免疫激活

研究发现，PMH+US处理能显著诱导骨肉瘤细胞发生ICD，表现为钙网蛋白（CRT）在细胞表面的暴露增加，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核释放，以及ATP分泌增加。同时，Western blotting结果显示PMH处理（尤其是PMH+US）能激活cGAS-STING信号通路，表现为STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平上调。将经不同处理的骨肉瘤细胞与骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）共培养后，PMH+US组能最有效地促进BMDCs的成熟（CD80、CD86、CD40、MHC II表达上调）。这表明PMH介导的增强型SDT能触发强效的肿瘤细胞ICD并引发抗肿瘤免疫应答。

3.6. PMH介导的SDT的转录组机制研究

通过mRNA测序比较PMH+US处理与未处理的骨肉瘤细胞的基因表达谱，发现大量差异表达基因（DEGs）。KEGG通路富集分析显示这些基因显著富集于MAPK信号通路、p53信号通路、凋亡和DNA复制等与ROS生成和凋亡过程密切相关的通路。GO分析表明DEGs主要参与免疫应答的正调控、对氧气和氧化应激的反应以及线粒体损伤等过程。关键基因如促凋亡基因（Gadd45b, Casp8, Casp9）上调，抗凋亡基因Bcl2下调，氧化应激相关基因（Gss, Gsr）上调，以及线粒体编码基因（Mt-Th, Mt-Te）下调，进一步证实了PMH介导的SDT通过诱导细胞氧化应激和激活抗肿瘤免疫通路发挥抗癌作用。

3.7. SIS3联合PMH介导的SDT的体内抗肿瘤效果

在小鼠骨肉瘤模型中，模拟术后残留情境，局部应用载有PMH和SIS3的ODEX@CMCS水凝胶。结果表明，单独SIS3、PMH或两者联合（无US）对肿瘤生长抑制效果有限。PMH+US能抑制肿瘤生长，而PMH+SIS3+US联合治疗显示出最强的抗肿瘤效果，肿瘤生长抑制最显著，并显著延长了小鼠的生存期。组织学分析显示联合治疗组肿瘤细胞凋亡严重，细胞内ROS水平高，且CAFs标志物α-SMA表达和胶原沉积显著减少。免疫学分析表明，联合治疗显著增加了肿瘤内CD8⁺ T淋巴细胞的浸润和活化（TNF-α分泌增加），促进了树突状细胞在引流淋巴结中的成熟，提高了CD8⁺/CD4⁺ T细胞比率，增加了血液中的效应记忆T细胞和脾脏中的中央记忆T细胞比例，同时降低了肿瘤内调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）的比例，表明联合治疗有效缓解了免疫抑制微环境，激发了局部和全身性的抗肿瘤免疫应答。

本研究开发了一种整合CAFs重编程和增强型SDT的协同治疗策略。该策略通过PMH纳米声敏剂解决SDT过程中的缺氧和抗氧化屏障问题，显著提升ROS生成和ICD效应；同时利用SIS3抑制TGF-β/SMAD3信号通路，重编程CAFs，减少ECM沉积，改善免疫抑制微环境，从而促进免疫细胞浸润。局部水凝胶递送系统确保了药物的持续释放和靶向作用。研究结果表明，这种联合疗法在骨肉瘤模型中实现了显著的肿瘤生长抑制和强效的抗肿瘤免疫激活。该研究为克服实体瘤（特别是纤维化肿瘤）治疗中SDT疗效受限和免疫细胞浸润不足的难题提供了创新性的解决方案，展示了一种通过局部微环境重塑来增强抗肿瘤免疫的治疗新范式，具有重要的临床转化潜力。论文发表于《Bioactive Materials》期刊。