TLR4/NF-κB信号通过DNMT1介导的PEX5表观沉默抑制过氧化物酶体生物合成促进肾移植纤维化

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Activation of TLR4-NF-κB signaling in renal tubular epithelial cells facilitates renal allograft fibrosis by inhibiting peroxisome biogenesis

本研究针对肾移植后长期存活率低的核心问题——移植肾纤维化，揭示了TLR4/NF-κB信号通过上调DNMT1表达，进而甲基化PEX5启动子抑制过氧化物酶体生物合成的非炎症机制。研究人员通过临床样本分析、大鼠移植模型和细胞实验证实，靶向抑制DNMT1可恢复PEX5表达，改善脂质积累和氧化应激，显著延缓纤维化进程。该发现为改善移植肾长期存活提供了新的治疗靶点。

　　

肾移植是目前治疗终末期肾病最有效的方法，然而移植肾的长期存活率仍不理想。十年移植肾存活率仅为50%左右，其中慢性移植肾肾病是影响长期功能的主要障碍。移植肾间质纤维化的发生率在移植两年后超过65%，成为临床面临的严峻挑战。虽然非免疫因素如缺氧、免疫抑制剂毒性等已被确认为影响因素，但驱动肾纤维化的分子机制仍不清楚，这严重阻碍了有效治疗策略的开发。

传统上，Toll样受体4（TLR4）-核因子κB（NF-κB）信号通路在肾脏缺血再灌注损伤和免疫抑制剂（如环孢素A和他克莫司）引发的炎症反应中起核心作用。NF-κB不仅调节炎症和免疫反应，还参与细胞增殖、存活和代谢等非免疫生物过程。尽管NF-κB激活在急性肾损伤和缺血再灌注损伤的炎症中已有报道，但NF-κB是否通过非炎症机制促进肾移植纤维化仍不清楚。

近年来，脂质代谢紊乱如脂肪酸氧化受损与肾纤维化相关，而过氧化物酶体作为参与脂肪酸β-氧化、醚脂质合成和活性氧代谢的重要细胞器，其功能异常可能加剧纤维化进程。过氧化物酶体生物生成由PEX蛋白家族调控，其中PEX5是过氧化物酶体基质蛋白导入的关键蛋白。然而，PEX5表达是否在移植肾中下调及其对纤维化进展的贡献尚待阐明。

在这项发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》的研究中，张丹团队深入探讨了NF-κB激活通过表观遗传机制调控PEX5表达的新机制，为理解肾移植纤维化的发病机制提供了全新视角。

研究人员运用了多个关键技术方法：利用Nephroseq数据库进行生物信息学分析临床移植肾样本基因表达谱；建立大鼠肾移植模型（F344-to-Lewis）进行体内功能验证；采用人肾近端小管上皮细胞系HK-2进行体外机制研究；通过染色质免疫沉淀、甲基化DNA免疫沉淀、双荧光素酶报告基因等技术分析转录因子结合和DNA甲基化状态；对公共单细胞RNA测序数据集进行重新分析验证细胞类型特异性表达。

2.1. NF-κB抑制剂延迟了肾移植纤维化的进展

通过生物信息学分析发现，与对照组相比，慢性移植肾肾病III级组中有5474个差异表达基因，其中TLR和NF-κB信号通路显著富集。TLR4和NF-κB的转录水平在肾移植受者中显著升高，且与纤维化标志物波形蛋白（VIM）表达呈正相关。临床肾活检样本的Masson和免疫组化染色证实，随着纤维化严重程度增加，TLR4和磷酸化p65（p-p65）表达显著升高。在大鼠肾移植模型中，NF-κB抑制剂JSH-23治疗显著降低了VIM和I型胶原（Col I）表达，减少了胶原沉积，表明靶向抑制NF-κB信号可以延缓肾移植纤维化的进展。

单细胞RNA测序分析显示，NF-κB p65（RELA）主要在肾小管上皮细胞，特别是近端小管上皮细胞中表达。免疫荧光染色发现，高纤维化患者的近端小管上皮细胞中E-钙黏蛋白表达降低而VIM表达升高，证实上皮-间质转化（EMT）参与移植肾纤维化的发生。

2.2. NF-κB信号通路激活减少了过氧化物酶体数量

数据库分析显示TLR4和NF-κB表达与过氧化物酶体标志物过氧化氢酶（CAT）呈负相关，且过氧化物酶体标志物CAT和ABCD3随着肾移植纤维化进展而逐渐下降。免疫组化染色证实CAT和ABCD3表达与纤维化严重程度呈负相关。在大鼠模型中，JSH-23处理逆转了CAT和ABCD3的下调。过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）激动剂非诺贝特（Fen）可以逆转NF-κB诱导的CAT和ABCD3下调，同时抑制Col I和VIM表达，表明NF-κB激活导致的过氧化物酶体数量减少促进了肾移植纤维化的进展。

2.3. PEX5减少介导的RTECs中过氧化物酶体生物合成抑制导致脂质积累和ROS清除能力下降

在16个人类验证的PEX基因中，PEX5在纤维化进展过程中下调最显著，其表达与间质标志物VIM呈负相关。临床肾活检标本显示，随着移植肾纤维化进展，PEX5表达下降。HK-2细胞中PEX5敲除导致过氧化物酶体丰度减少，表现为CAT和ABCD3表达降低，同时VIM、Col I和MMP7表达显著增加，上皮标志物E-钙黏蛋白显著减少。

PEX5敲除诱导了显著的脂质积累，并导致细胞内活性氧（ROS）水平升高。免疫抑制剂环孢素A（CsA）和他克莫司（Tac）提升了凋亡蛋白表达，导致HK-2细胞凋亡，而PEX5敲除加剧了免疫抑制剂诱导的凋亡，表明RTECs中PEX5表达降低通过诱导脂质积累和降低细胞对免疫抑制剂毒性作用的耐受性促进EMT。

2.4. PEX5过表达逆转了NF-κB激活诱导的脂质积累和免疫抑制剂诱导的RTECs凋亡

在NF-κB激活剂处理的HK-2细胞中过表达PEX5，可以逆转NF-κB诱导的间质表型，抑制脂质积累标志物perilipin 1（PLIN1）的表达。油红O和尼罗红染色显示PEX5过表达显著逆转了NF-κB激活剂诱导的脂质积累。流式细胞术和免疫荧光分析表明，PEX5过表达减弱了CsA和Tac诱导的ROS水平升高，同时减少了免疫抑制剂诱导的HK-2细胞凋亡。在大鼠移植模型中，非诺贝特治疗改善了肾功能，增加了PEX5表达，抑制了CsA诱导的肾损伤分子-1（KIM-1）上调。

2.5. NF-κB独立于炎症信号通路调控PEX5表达

相关性分析显示PEX5表达与TLR4和NF-κB水平呈负相关。HK-2细胞中p65敲低增加了PEX5蛋白水平以及过氧化物酶体标志物CAT和ABCD3的表达，而NF-κB激活剂1处理显著下调了PEX5、CAT和ABCD3蛋白水平。虽然NF-κB激活剂处理显著诱导了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达，但使用相应的中和抗体并不能恢复PEX5 mRNA或蛋白表达水平，表明NF-κB调控PEX5不依赖于其经典的炎症信号通路。染色质免疫沉淀实验显示p65不与预测的PEX5启动子区域结合，表明NF-κB对PEX5的下调可能通过间接的非炎症机制发生。

2.6. DNMT1介导NF-κB激活诱导的PEX5表达抑制

在纤维化移植肾中，DNMT1上调最显著，而其他DNA甲基转移酶表达无显著变化。DNMT1表达与TLR4和NF-κB水平呈正相关，与PEX5表达呈负相关。临床样本中，随着纤维化进展，DNMT1表达逐渐增加。DNMT1特异性抑制剂DNMT1-IN-3处理可以逆转NF-κB激活剂诱导的PEX5和CAT表达降低，并抑制纤维化相关分子标志物的表达。

甲基化DNA免疫沉淀实验显示，NF-κB激活剂处理显著增加了PEX5启动子区域的甲基化水平。JASPAR数据库分析发现DNMT1启动子区域内存在 putative RELA结合位点，染色质免疫沉淀实验证实p65直接结合到该预测位点。双荧光素酶报告基因实验表明NF-κB激活显著增强DNMT1转录活性，而突变该结合位点后启动子不再响应NF-κB激活。DNMT1抑制剂处理显著增加PEX5 mRNA水平，甲基化特异性PCR证实DNMT1-IN-3处理显著降低PEX5启动子甲基化水平。

2.7. DNMT1抑制减轻NF-κB介导的氧化应激和肾纤维化

DNMT1抑制剂处理有效逆转了NF-κB激活诱导的脂质积累，显著降低细胞内ROS水平。同时，DNMT1-IN-3和NF-κB抑制剂JSH-23均减弱了免疫抑制剂诱导的ROS积累。在大鼠肾移植模型中，DNMT1-IN-3处理恢复了PEX5和过氧化物酶体标志物ABCD3的表达，同时抑制纤维化标志物VIM，改善了肾功能，表现为血清肌酐（SCR）和血尿素氮（BUN）水平降低。组织学分析进一步证实DNMT1-IN-3处理增强PEX5和ABCD3表达，减轻间质纤维化和肾损伤。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示了NF-κB/DNMT1/PEX5轴通过表观遗传机制调控过氧化物酶体功能，参与肾移植纤维化的新机制。该通路不依赖于NF-κB经典的炎症功能，而是通过上调DNMT1表达，进而甲基化PEX5启动子抑制过氧化物酶体生物合成，导致脂质积累、ROS水平升高和细胞凋亡，最终加速肾损伤和纤维化。

与传统的抗炎治疗策略不同，靶向DNMT1可能提供一种新的治疗途径，通过恢复过氧化物酶体功能直接缓解纤维化进程。DNMT1特异性抑制剂DNMT1-IN-3相比广谱DNMT抑制剂具有更好的特异性，可最小化表观遗传干扰风险，具有较高的转化潜力。

研究还发现多种组蛋白修饰酶（如EP300、HDACs、EZH2等）在纤维化移植肾中失调且与PEX5表达负相关，提示除DNA甲基化外，其他表观遗传机制也可能参与PEX5抑制，值得进一步研究。

该研究的局限性在于尚未明确TGF-β信号通路与NF-κB/DNMT1/PEX5轴的相互作用，且主要关注肾小管上皮细胞，而成纤维细胞和免疫细胞中DNMT1的高表达提示其可能通过不同机制参与纤维化。单细胞转录组分析显示NF-κB/DNMT1/PEX5轴在近端小管上皮细胞中转录活性最高，但DNMT1在其他细胞类型中的独立作用仍需深入探讨。

总之，这项研究为理解肾移植纤维化的分子机制提供了新视角，提出了靶向DNMT1-PEX5-过氧化物酶体轴的治疗策略，为改善移植肾长期存活提供了潜在的新靶点。