基于计算方法的FLT3野生型与突变体结构特征行为解析及其在急性髓系白血病治疗中的意义

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Understanding the characteristic behaviour of the wild-type and mutant structure of FLT3 protein by computational methods

本研究针对急性髓系白血病（AML）中高频突变的FLT3基因，通过分子动力学模拟、聚类分析和正态模式分析等计算方法，深入探究了FLT3酪氨酸激酶结构域点突变（Y842C/F）和近膜结构域内部串联重复突变（ITD）对蛋白质构象稳定性、灵活性及致密性的影响。研究揭示了不同突变导致FLT3蛋白动态行为差异的分子机制，为开发靶向这些突变体的有效治疗策略提供了关键的结构见解，对推动AML的精准治疗具有重要意义。

　　

在血液系统恶性肿瘤中，急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）以其高度的异质性和侵袭性著称，尤其困扰着儿童和成人患者。其中，FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）基因的突变被公认为关键的预后标志物，大约30%的AML病例携带FLT3突变，这与疾病的高复发风险和不良预后密切相关。FLT3突变主要分为两种类型：发生在酪氨酸激酶结构域（Tyrosine Kinase Domain, TKD）的点突变或缺失（约占7-10%的AML病例），以及发生在近膜（Juxtamembrane, JM）结构域的内部串联重复（Internal Tandem Duplication, ITD）突变（约占20-30%的AML病例）。这些突变导致FLT3受体发生不依赖配体的活化，破坏了JM区与激酶结构域之间的自身抑制性相互作用，进而引发FLT3的自磷酸化，并持续激活下游STAT5、MAPK和AKT等信号通路，最终促进细胞异常增殖并抑制其凋亡。尽管针对FLT3的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs）已应用于临床，但治疗过程中常出现获得性耐药，其中FLT3-ITD蛋白上发生次级TKD点突变（如Y842C）是导致耐药的重要原因之一。因此，深入理解野生型（Wild-Type, WT）和不同突变型FLT3蛋白的结构动态特征，对于开发更有效、更持久的靶向治疗策略至关重要。

为了回答上述问题，由瑞典隆德大学（Lund University）的Saleena Younus、?zge Tatli、Ahmad Nasimian、Julhash U. Kazi和Lars R?nnstrand组成的研究团队，在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上发表了他们的研究成果。他们利用计算生物学方法，系统性地研究了FLT3蛋白在多种突变下的结构行为。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，他们利用来自AML患者的FLT3-ITD序列（含7个氨基酸"REYEYDL"的重复，即W51突变），通过SWISS-MODEL服务器进行同源建模，获得了FLT3-ITD的蛋白质结构模型，并利用GMQE、pLDDT、Ramachandran图、MolProbity评分以及与晶体结构（如1RJB）进行比对（RMSD约0.4 ?）来评估模型质量。其次，他们使用PyMOL软件在FLT3-WT（采用AlphaFold数据库中的P36888结构作为对照）和已构建的FLT3-ITD模型基础上，分别引入TKD点突变Y842C和Y842F，构建了六种不同的FLT3蛋白结构体系进行研究。核心分析手段是采用GROMACS 2023.2软件包，使用CHARMM27力场和TIP3P水模型，对六个FLT3结构（FLT3-WT, FLT3-Y842C, FLT3-Y842F, FLT3-ITD, FLT3-ITD-Y842C, FLT3-ITD-Y842F）进行了为期300纳秒的分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟。通过对模拟轨迹的分析，计算了均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）、均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation, RMSF）、回转半径（Radius of Gyration, Rg）、溶剂可及表面积（Solvent Accessible Surface Area, SASA）和分子内氢键（H-Bond）数量等关键参数，以评估蛋白质的整体稳定性、局部灵活性、紧凑性、溶剂暴露程度和内部相互作用。此外，研究还辅以基于RMSF数据的K-means聚类分析，以量化氨基酸残基水平的柔性分布；并利用DynaMut2网络服务器的正态模式分析（Normal Mode Analysis, NMA）工具，从能量和振动模式的角度验证和可视化蛋白质的动态运动。

3.1. 建模蛋白的评估

研究人员首先对通过同源建模获得的FLT3-ITD结构进行了质量评估。该模型的GMQE（全局模型质量估计）值为0.75，平均pLDDT（预测局部距离差异测试）得分为74.92，与作为模板的AlphaFold FLT3-WT结构（P36888，pLDDT=75.19）高度相似，表明其主链预测具有较高的可信度。Ramachandran图显示89.68%的氨基酸残基位于优势区域，MolProbity评分为1.50，均支持模型的立体化学合理性。将建模的FLT3-ITD结构和AlphaFold的FLT3-WT结构与已知的FLT3晶体结构（1RJB，仅包含JM和TKD区域）进行叠合比较，RMSD值分别为0.409 ?和0.419 ?，证实了计算模型在已解析区域的高精度。值得注意的是，模型和晶体结构中均存在一些pLDDT评分较低（<50）或未被解析的柔性区域，例如TKD1中的长环状区域（723-762），这反映了这些区域固有的动态特性。结构比较显示，ITD突变（"REYEYDL"的重复）导致JM-Z区域原有的β链结构发生改变，形成了短螺旋和更长的环状结构，这可能破坏了JM区的自身抑制作用。

3.2. FLT3-WT和FLT3-ITD蛋白模型的结构特征

FLT3蛋白包含胞外区、跨膜区、近膜区和胞内激酶区。本研究聚焦于JM和TKD区域（残基572-958）。结构比对直观地展示了ITD突变如何引起JM-Z motif和激酶区激活环（A-Loop）的构象变化，这为理解其导致组成性激活提供了结构基础。

3.3. 分子动力学模拟

MD模拟是本研究的核心，旨在从动态角度揭示突变对FLT3蛋白特性的影响。

3.3.1. 均方根偏差

RMSD分析反映了蛋白质整体结构的偏离程度。模拟结果显示，所有突变体均影响了FLT3的构象稳定性。具体而言，FLT3-Y842C和FLT3-ITD-Y842F的平均RMSD值最高（分别为0.87 nm），表明其结构偏离初始状态的程度较大，灵活性增加。而FLT3-Y842F的平均RMSD值最低（0.72 nm），显示出相对刚性的构象。与FLT3-WT（0.86 nm）相比，FLT3-ITD（0.78 nm）的RMSD略低，但在模拟早期表现出较大的波动。

3.3.2. 均方根涨落

RMSF分析了氨基酸残基水平的局部柔性。FLT3-ITD表现出最高的平均RMSF值（0.30 nm），尤其在JM区和柔性环区（723-762）波动显著，印证了ITD突变引入的全局灵活性。相比之下，点突变Y842C和Y842F在FLT3-WT背景下均降低了整体的波动性（平均RMSF分别为0.17 nm和0.20 nm），使蛋白变得更刚性。当这些点突变与ITD结合时（FLT3-ITD-Y842C和FLT3-ITD-Y842F），其平均RMSF值（0.19 nm和0.16 nm）低于单独的ITD突变，表明Y842C/F在一定程度上约束了ITD所引入的过度柔性。

3.3.3. 回转半径

Rg用于评估蛋白质的整体紧凑性。分析表明，所有突变体的平均Rg值都低于或接近FLT3-WT（1.93 nm），其中FLT3-ITD-Y842F的紧凑性最高（Rg=1.84 nm）。综合来看，突变体的结构紧凑性顺序为：FLT3-ITD < FLT3-ITD-Y842C < FLT3-ITD-Y842F < FLT3-Y842C < FLT3-WT，这表明突变，特别是组合突变，影响了蛋白的全局折叠和致密程度。

3.3.4. 溶剂可及表面积

SASA值反映了蛋白质表面的溶剂暴露程度。所有突变体的平均SASA值均高于FLT3-WT（198.52 nm2），其中FLT3-ITD的SASA值最高（219.73 nm2），说明其溶剂暴露程度最大，结构最为松散。这与Rg和RMSF的结果一致，共同揭示了ITD突变对蛋白结构的去稳定化效应。

3.3.5. 分子内氢键相互作用

分子内氢键是维持蛋白质结构稳定性的关键。FLT3-WT在模拟过程中平均形成292个氢键。大多数突变体的氢键数量略有减少，例如FLT3-Y842C为275个，FLT3-ITD-Y842C为283个。而FLT3-ITD（288个）和FLT3-ITD-Y842F（290个）的氢键数量与WT接近甚至略高，提示这些突变体可能通过调整内部相互作用网络来适应突变带来的结构变化。

3.4. 聚类分析

基于RMSF数据的K-means聚类分析进一步量化了残基水平的柔性。结果显示，FLT3-ITD中处于低波动（稳定）簇的氨基酸残基数量最少（114个），再次证实了其高度的整体灵活性。而FLT3-Y842C（294个）、FLT3-ITD-Y842C（289个）和FLT3-ITD-Y842F（313个）则拥有更多处于稳定簇的残基，表明Y842C/F点突变，尤其是在ITD背景下，能够增加局部结构的刚性。

3.5. 使用DynaMut2计算评估WT和突变型FLT3的构象动力学

DynaMut2的NMA从能量景观的角度提供了蛋白质可能的内在运动模式。可视化分析发现，FLT3-WT和FLT3-Y842C的运动轨迹起始方向相似（先下后上），而其他突变体（FLT3-Y842F, FLT3-ITD, FLT3-ITD-Y842C, FLT3-ITD-Y842F）则呈现出相反的运动方向（先上后下）。这种运动模式的差异暗示了不同突变可能将蛋白质导向不同的构象能谷，从而影响其功能状态。

研究的讨论部分对上述发现进行了整合与深化。蛋白质的构象稳定性与其功能直接相关，突变可通过改变稳定性导致功能失调，这在癌症中尤为常见。本研究通过计算手段揭示了FLT3不同突变体独特的动态行为特征：FLT3-ITD突变主要通过破坏JM区的自抑制作用，显著增加了蛋白质的整体柔性，驱动其向活化构象转变。而Y842位点的点突变（Y842C和Y842F）则因其侧链物理化学性质的改变（如半胱氨酸的小侧链、苯丙氨酸的庞大芳香环）以及最关键的是丧失了酪氨酸磷酸化能力，主要影响了激酶活化环（A-Loop）的局部动态和稳定性。Y842C倾向于使局部结构更紧凑和稳定，而Y842F则可能引起部分刚性化和构象限制。当ITD突变与Y842点突变结合时，产生了叠加效应：ITD带来的全局柔性增加与Y842点突变引入的局部刚性化/稳定化共同作用，最终导致蛋白质构象发生重排，削弱了自抑制状态，更倾向于形成一种开放的、类似活化的激酶构象。这很好地解释了为何这些突变体会导致FLT3的组成性激活，并持续驱动下游如STAT5、MAPK、AKT等信号通路，促进白血病发生。

本研究也存在一些局限性。计算模型的准确性依赖于模板和算法，尽管进行了验证，但对于高度柔性区域仍存在不确定性。300纳秒的MD模拟提供了重要见解，但更长时间的模拟或使用更新的力场（如CHARMM36m）可能揭示更长期的动态行为。此外，本研究主要针对非磷酸化的"apo"状态蛋白，未来引入ATP/Mg²⁺或磷酸化模拟物进行研究，将能更全面地揭示Y842磷酸化在调控过程中的具体作用。最终，将这些计算发现转化为经实验验证的有效抑制剂，是未来的关键方向。

综上所述，这项研究通过综合运用同源建模、分子动力学模拟、聚类分析和正态模式分析等计算结构生物学方法，首次构建并系统分析了携带特定ITD突变（W51）的FLT3蛋白模型，深入揭示了FLT3酪氨酸激酶结构域点突变（Y842C/F）和近膜结构域ITD突变对其构象稳定性、灵活性和动态特征的差异化影响。研究成果不仅增进了对FLT3驱动AML分子机制的理解，更重要的是，为针对不同FLT3突变体（尤其是难治的ITD伴随TKD突变）进行合理化药物设计提供了宝贵的结构基础和理论依据，对推动急性髓系白血病的精准治疗具有重要的科学意义和临床转化潜力。