综述：一个主题的变奏：效应子触发免疫的非经典机制

《Current Opinion in Plant Biology》：Variations on a theme: Non-canonical mechanisms of effector-triggered immunity

这篇综述系统梳理了植物效应子触发免疫（ETI）的非经典机制，突破传统“基因对基因”模型，详细阐述了NLR（核苷酸结合、富含亮氨酸重复序列）受体多样性、配对NLR作用模式、整合结构域（ID）的识别机制，以及辅助NLR（如NRC/ADR1/NRG1）的激活通路，为植物免疫受体设计和病害防控提供新视角。

　　

引言

Harold H. Flor 通过研究亚麻及其锈病病原体的互作，开创性地提出了寄主反应与寄生菌致病性之间的“基因对基因”关系理论。该理论指出，寄主中每个控制反应的基因都对应病原体中一个控制致病性的基因。病原体的基因若能被携带对应抗性（R）基因的植物识别，则被称为无毒（Avr）基因。如今我们知道，Avr基因编码的是病原体效应子，这些分子被递送到宿主细胞中以操纵宿主细胞机制。Flor的发现精准描述了效应子触发免疫（ETI）的过程，该过程涉及宿主对病原体编码分子的识别，且许多特征在植物和动物中共享。

大多数R基因编码NLR（Nucleotide-binding, Leucine-rich-repeat）免疫受体，但也存在许多有趣且具有启发意义的例外。R基因通常通过筛选自然变异中赋予病原体抗性的位点而被鉴定，部分则通过诱变技术发现。本文总结了新型免疫受体鉴定的最新进展，以及对其分子机制的理解，包括经典的NLRs。

NLRs在植物中广泛保守但N端结构域多变

大多数NLR蛋白具有NB-ARC（Nucleotide-binding Apaf-1, Resistance, Ced4）和LRR（Leucine-rich repeat）结构域，其前导是可变的N端结构域，例如CC（coiled-coil）、TIR（Toll-like, Interleukin, Resistance）或CC_RPW8（Coiled-coil domain homologous to RPW8）结构域。CC-NLR、TIR-NLR和CC_RPW8-NLRs在植物物种间普遍保守，尽管单子叶植物中已丢失TIR-NLRs。近期的系统基因组分析强调了这些NLR家族内部先前未被充分认识的多样性。此外，也鉴定到其他N端信号结构域，例如苔藓植物中的α/β水解酶结构域和蛋白激酶结构域。蕨类植物基因组携带许多具有无序区域N端信号结构域的NLRs，被称为“无序N端NLRs（disN-NLRs）”。

地钱的CC-NLRs可在双子叶模式植物本氏烟中发挥作用。此外，将自激活CC-NLR（NRC4^D478V）的N端约20个氨基酸替换为地钱CC-NLR中对应的氨基酸，足以诱导细胞死亡。由于NRC4^D478V可寡聚化成六聚体，具有替代N端信号结构域的地钱NLRs很可能也通过寡聚化发挥作用。这强烈表明，尽管N端结构域在陆地植物谱系间存在结构和功能多样性，但通过NB-ARC结构域进行寡聚化作为NLRs的调控机制是保守的。

寡聚化不仅是植物NLRs激活的共同主题，而且跨越了界域。拟南芥的ZAR1和小麦的Sr35等CC-NLRs在效应子识别后，寡聚成具有钙通道活性的五聚体“抗病小体”。另一方面，拟南芥的RPP1和本氏烟的Roq1等TIR-NLRs在与对应效应子直接相互作用后寡聚化成四聚体，组装TIR结构域形成“二聚体之二聚体”结构，从而具备NADase活性。这种诱导的寡聚化可能作为一个严格的检查点以防止随机激活，因为NLRs的错误激活常导致自身活性和细胞死亡。然而，诱导寡聚化是许多（并非所有）NLRs的共同特征。

用配对NLRs重新审视Flor的基因对基因模型

Flor所研究的抗性性状均为单基因控制。然而，许多编码NLR蛋白的R基因需要另一个NLR蛋白才能发挥功能，这些NLR要么由同一基因座编码（配对NLR），要么位于不同基因座（传感器/辅助NLR；见下文）。配对NLR在遗传上连锁，通常以头对头方向反向转录。

RPP2A和RPP2B是最早被鉴定的配对NLRs之一，尽管它们的基因并非反向转录。一个罕见的乙基甲磺酸盐（EMS）诱变事件同时发生在RPP2A和RPP2B上，揭示这两个基因对抗Hyaloperonospora arabidopsidis（Hpa）的抗性都是必需的。RPS4和RRS1配对NLRs被鉴定为分别赋予对Pseudomonas syringae和Ralstonia solanacearum抗性的基因，但在RPS4或RRS1中发生突变并对Colletotrichum higginsianum易感的突变体的鉴定，为证明这两个基因作为一对发挥作用铺平了道路。对于水稻配对NLRs RGA4和RGA5，遗传作图标定了候选基因为RGA4，但互补实验未能显示在缺乏RGA5的情况下RGA4能介导抗病性，证明了RGA4和RGA5两者对识别AVR-Pia都是必需的。此后，许多其他配对NLRs被鉴定出来。

配对NLRs可分类为“传感器”和“执行器”NLRs。传感器NLRs的N端信号结构域抑制相应执行器NLRs结构域的自身激活。拟南芥中传感器NLRs的TIR结构域缺乏NADase活性所需的氨基酸，而传感器NLRs的C-JIDs（C端jelly roll和Ig样结构域）与执行器NLRs相比保守性较低。一些传感器NLRs具有截短的结构域，例如拟南芥的CHS1或TN2缺乏LRR结构域，需要邻近的NLR蛋白SOC3来发挥功能。与Pm5e配对并赋予对白粉病抗性的小麦NLR RXL具有部分截短的NB-ARC结构域。这些研究突出了传感器NLRs在抑制执行器NLRs中的作用。然而，像Pikp-1/Pikp-2这样的配对NLRs两者都是激活所必需的，并且RRS1-R对于RPS4的去抑制是必需的，这需要进一步的机制研究。

两项研究鉴定出 NLRs 是相连的串联激酶 R 蛋白赋予抗病性所必需的。这让人联想到 ZAR1 感知受体样胞质激酶（RLCKs）的变化，以及依赖于 NRC 的 CC-NLR Prf 感知 Pto 和 Fen 的变化。Pto、Fen 和 Prf 位于相同的基因组簇中，而谷物 NLR/串联激酶对基因在基因组中彼此相邻。小麦 Sr62 串联激酶及其相邻的 Sr62 NLR 在与 Puccinia graminis tritici（Pgt）的 AvrSr62 相互作用后被激活。在同一基因座的另一个单倍型中，它赋予对白粉病和 M. oryzae 的抗性，Wheat Tandem NBD 1（WTN1）NLR 需要串联激酶 Wheat Tandem Kinase 3（WTK3）/Resistance on wheat 4（RWT4）来激活。PWT4 与 PWT3 是 M. oryzae 的关键宿主特异性决定因子，被小麦中的 RWT4 识别。RWT4 直接磷酸化 PWT4，从而诱导与 NLR 的相互作用和激活。

其他具有独特特征的配对 NLRs 也已被鉴定。例如，识别 M. oryzae 不同菌株的水稻 NLR Pit1 和 Pit2 在基因组中头对尾相邻定位，中间有 Histone H2B 隔开。尽管这偏离了配对 NLRs 的分类，但 Pit1 过表达引起的细胞死亡被 Pit2 抑制，这与其它已报道的配对 NLRs RGA4/RGA5 和 RRS1/RPS4 相似。最初被鉴定为配对 NLRs 的 RPP2C 和 RPP2D 与 RPP2A 和 RPP2B 位于同一簇中，并在数量上贡献于 RPP2A/RPP2B 介导的 Hpa 抗性。需要进一步的机制研究来理解这四个 NLRs 如何协同工作。

你有ID（整合结构域）吗？

配对 NLRs 的传感器通常具有非经典结构域，因此被称为具有整合结构域（NLR-IDs）的 NLRs。NLR-IDs 可能从效应子靶标整合到经典 NLR 结构中进化而来。传感器 NLR 的 IDs 在识别（从而“感知”）对应效应子方面发挥作用。

对各种植物蛋白质组数据库的分析表明，锌指（ZF）BED、S/T蛋白激酶（PK）、WRKY和HMA（重金属关联）结构域是最普遍的IDs之一。WRKY和HMA结构域尤其成熟，在配对NLRs中作为效应子识别的诱饵发挥作用。相比之下，ZF-BED结构域存在于附近未鉴定出其他NLRs的NLRs中，因此被提议单独发挥作用。赋予小麦对条锈病抗性的Yr5和YrSP共享相同的ZF-BED序列却识别不同的病原小种，表明ZF-BED不是效应子识别的唯一决定因素。ZF-BED结构域影响Pm6Sl（一种介导小麦白粉病抗性的Aegilops longissima NLR蛋白）中CC-BED结构域诱导的细胞死亡，表明其在下游信号传导或其他功能中的潜在作用。

传感器NLR激活后辅助NLRs的寡聚化

最早被鉴定的“辅助”NLR基因是NRC1和NRG1。这两个基因被鉴定为除了实验中使用的R-Avr对（分别是Cf-9/Avr9、N/p50）之外，细胞死亡所必需的额外R基因，这明显偏离了Flor的基因对基因模型。另一个辅助NLR ADR1，最初通过激活标签突变体鉴定，该突变体由于插入的激活标签附近基因的过表达而表现出自身免疫表型，后来被证明在其他R基因下游发挥作用，类似于NRG1。这些“辅助”NLRs在由不同NLRs（如TNLs或CNLs，分类为“传感器”NLRs）检测到病原体效应子后支持免疫反应。传感器-辅助NLRs在遗传上不连锁，并且彼此之间不以高亲和力相互作用，尽管传感器和辅助NLRs之间的瞬时相互作用已有报道。只有辅助NLR参与抗病小体的形成。NRC4和NRC2形成同源抗病小体，由不包含传感器NLR或已识别效应子的六聚体组成。

EDS1、SAG101和PAD4是一个具有脂酶样结构域和独特EP（EDS1-PAD4特异性）结构域的蛋白质家族，EDS1是迄今为止大多数TIR-NLR信号传导所必需的。EDS1/SAG101和EDS1/PAD4异源二聚体在TIR-NLRs效应子依赖性激活后分别招募NRG1和ADR1。两项研究表明，TIR-NLRs的NADase活性产生的小分子与EDS1/SAG101或EDS1/PAD4异源二聚体结合，施加构象变化，被NRG1或ADR1“感知”。EDS1-PAD4和EDS1-SAG101与辅助NLRs ADR1和NRG1的最新结构研究揭示了三聚体的形成。目前尚不清楚NRG1或ADR1寡聚体之后是否会从EDS1复合物上解离。NRG1的自关联仅在质膜上观察到，而EDS1-SAG101-NRG1关联在细胞核中观察到。因此，三聚体EDS1/SAG101/NRG1复合物可能在细胞核中具有防御基因诱导的额外作用，这需要进一步研究。

TIR结构域在ETI及其他方面的作用

拟南芥中有约150个具有TIR结构域的基因。大多数基因是TIR-NLRs，但有些基因只有TIR结构域或TIR结构域与NB结构域融合。另一方面，单子叶植物中缺乏TIR-NLRs，尽管已鉴定出具有TPR（四肽重复样）结构域而非LRR结构域的基因。此外，单子叶植物缺乏TIR-NLRs的下游组分，如NRG1和SAG101，但它们携带ADR1、EDS1和PAD4同源物。在水稻钙传感器ROD1自激活突变体的抑制子正向遗传筛选中，在仅含TIR的基因OsTIR以及OsADR1、OsEDS1和OsPAD4中发现了突变。OsTIR催化生成pRib-AMP/ADP，诱导水稻EDS1-PAD4-ADR1复合物的形成，这与pRib-AMP/ADP在拟南芥EDS1-PAD4-ADR1复合物形成中的特异性一致。这项卓越的研究强调了这些免疫机制在单子叶和双子叶植物中的共通性。ZmTIR1和ZmTIR2的瞬时过表达导致细胞死亡，该过程依赖于ZmEDS1、ZmPAD4、ZmADR1。ZmTIRs可以在体内形成凝聚体，类似于拟南芥TIR结构域以底物依赖性方式形成凝聚体。这种凝聚体形成可能是在缺乏NB-ARC结构域或其他寡聚化结构域的情况下诱导TIR结构域寡聚化和NADase活性的一种机制。

最近的一份预印本将拟南芥TIR结构域与一个寡聚化结构域融合，显示近一半的TIR结构域基因可以诱导细胞死亡。最近的报告表明，含TIR结构域的基因在共生、微生物组反馈及其在辅助NLRs下游的功能中具有额外作用。例如，ISI是拟南芥中响应有益真菌内生菌Serendipita indica而诱导的TIR-NLR。真菌内生菌Serendipita indica产生的dAdo（脱氧腺苷）诱导野生型拟南芥细胞死亡，但对dAdo处理不敏感的isi突变体中细胞死亡减少。这表明有益微生物共同选择了由TIR-NLRs启动的细胞死亡途径。TIR结构域基因在植物谱系间的进化保守性，其中一些表现出EDS1非依赖性细胞死亡，进一步表明TIR结构域基因在效应子识别和EDS1依赖性免疫激活之外具有额外作用。

通过寡聚化和翻译后修饰抑制NLRs

ZAR1和其他NLRs的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）显示，非活性形式比激活形式迁移更快。从本氏烟中纯化的非活性NRC2形成二聚体。在高浓度下也鉴定出NRC2的丝状结构。这些寡聚结构有效地防止NLRs的N端信号结构域彼此过于接近。NLRP3“笼”的抑制性寡聚化也显示了类似的机制，其中非活性NLRP3通过其LRR-LRR相互作用形成双环笼，抑制NLRP3 N端信号结构域的诱导接近。这种抑制性寡聚化也可能有利于确保在效应子识别后能够快速实现寡聚化，通过将寡聚化所需的原体保持在附近。

拟南芥RRS1/RPS4配对NLRs在非活性状态和效应子依赖性激活后都形成寡聚体，其大小无法区分。另一个拟南芥配对NLR CHS3/CSA1在本氏烟中表达时，在自激活状态下形成寡聚体。配对的CC-NLRs，如水稻Pikp-1/Pikp-2和小麦RXL/Pm5e以异源复合物形式存在。另一方面，NRG1的旁系同源物NRG1.3（NRG1C）与修饰的EDS1/SAG101复合物强结合并负调控其活性。

NLRs的翻译后修饰也可能负调控NLRs。例如，CC-NLRs和TIR NLRs的磷酸化可能阻止抗病小体形成。大麦CC-NLR BSR1在其NB-ARC结构域被磷酸化，阻止其组装成抗病小体。CPK3对TIR-NLR SNC1保守的Ser26磷酸化阻止其NADase活性。有趣的是，这个丝氨酸残基在哺乳动物TIR结构域蛋白SARM1中是保守的，该丝氨酸残基的磷酸化也会导致SARM1的NADase活性降低。钙信号对于下游免疫反应至关重要，特别是通过CPKs连接细胞表面免疫与细胞内免疫。这些激酶如何被调控，以及这些组分是否提供细胞表面受体介导的免疫与效应子触发免疫之间的因果联系仍未解决。

结论与展望

近年来，许多额外的R基因被克隆，虽然许多编码NLRs，但也发现了额外的结构域架构。现在发现许多NLRs与另一个NLR或另一个蛋白质共同发挥作用，扩展了Flor的基因对基因模型，为ETI的经典主题提供了变奏。非NLR的细胞内免疫受体，如串联激酶或仅含TIR结构域的蛋白质，不断被鉴定，拓宽了植物免疫检测机制的范围。这些NLRs如何执行此类角色，以及非NLR基因如何响应效应子，将是未来研究的一个有趣方向。