原位接种产己酸菌群对浓香型白酒窖泥原核微生物多维演替的影响及窖泥老化的"滞后-老化双相"假说验证

《Current Research in Microbial Sciences》：The effect of autochthonous caproic acid-producing consortia inoculation on the multi-dimensional prokaryotic succession of bottom pitmud used for the Chinese Strong-Flavor Baijiu Fermentation

本研究针对浓香型白酒(CSFB)窖泥老化过程中产己酸菌(CPBs)的作用机制不清问题，通过连续液态富集和固态预培养自体CPBs，进行五轮批次发酵人工加速窖泥老化。研究发现CPBs在固态新窖泥中生长缓慢，多维原核群落演替模式验证了"滞后-老化双相"假说，证实CPBs接种促进窖泥老化，为人工窖泥老化和靶向生物修复提供了新途径。

　　

在中国传统白酒酿造工艺中，浓香型白酒(Chinese Strong-Flavor Baijiu, CSFB)以其独特的风味特征备受青睐，而其独特风味的形成与窖泥(pitmud)这一特殊微生态系统密切相关。窖泥作为CSFB发酵的核心载体，是众多厌氧原核微生物的主要栖息地，其中产己酸菌(caproic acid-producing bacteria, CPBs)被认为是窖泥老化的关键功能菌群。己酸(caproic acid)作为CSFB的关键风味成分，其含量与窖泥老化程度呈正相关。然而，长期以来，CPBs在窖泥老化过程中的具体作用机制仍不明确，这严重制约了人工窖泥老化技术的开发和应用。

传统窖泥制备通常采用老窖泥、黏土、腐殖质等原料混合堆沤，但自然老化过程需要20-30年，周期漫长且效率低下。虽然已有研究尝试通过接种CPBs来加速窖泥成熟，但多数研究仅关注窖泥表层微生物群落，缺乏对窖泥垂直空间维度上微生物演替规律的深入探索。更为重要的是，先前研究发现人工接种CPBs只能短期内提高其丰度，长期发酵后CPBs比例反而下降，这与自然老化窖泥中CPBs逐渐积累的现象相矛盾。这种差异提示我们，CPBs在均质液态系统与复杂多相固态窖泥系统中的代谢模式可能存在显著差异。

为解决这一科学问题，安徽工程大学生物与食品工程学院的研究团队在《Current Research in Microbial Sciences》上发表了最新研究成果。研究人员创新性地提出了"滞后-老化双相"(Lag-aging dual-phase)假说，并通过多维度的实验设计系统验证了这一理论。研究首先从老窖泥和黄水(huangshui)中通过液态共发酵富集获得自体CPBs丰富菌群，然后将其与新鲜窖泥进行固态预培养，最后进行连续五批CSFB发酵，模拟窖泥自然老化过程。

研究采用的关键技术方法包括：从正常使用的老窖(≥40年)采集黄水和窖泥样本；通过非灭菌近天然黄水培养基(NNHS)进行CPBs的连续放大富集；利用16S rRNA基因扩增子测序分析原核微生物群落结构；通过高效液相色谱等技术测定理化参数(乳酸、乙醇、葡萄糖、乙酸、丁酸、己酸等)；采用PICRUSt2功能预测分析己酸合成通路相关酶基因丰度；运用线性混合效应模型统计分析多维窖泥样本数据。

3.1.液态CPBs富集

研究发现，通过窖泥-黄水液态共发酵，Caproiciproducens(主要为Caproicibacterium)的相对丰度从1.46%显著提高至34.55%，Clostridium_sensu_stricto_12也从0.04%增加至23.94%，成功实现了CPBs的富集。同时，乳酸杆菌(Lactobacillus)的丰度从64.93%下降至0.70%，表明CPBs在NNHS培养基中具有更强的竞争优势。

3.2.固态新窖泥中接种CPBs的单维生长模式

将液态富集的CPBs菌群接种至固态新窖泥后，Caproiciproducens的相对丰度从11.80%逐渐下降至5.24%，而Clostridium_sensu_stricto从10.87%下降至2.71%。与液态系统相比，CPBs在固态窖泥中的生长优势减弱，但原核微生物群落的丰富度(Chao1)和多样性(Simpson)逐渐增加并趋于稳定。

3.3.液态富集与固态预培养的理化性质差异

液态富集过程中，葡萄糖、乳酸和乙醇等碳源被依次消耗，丁酸和己酸含量逐渐增加至1.88g/L和1.97g/L，pH值下降。而在固态预培养中，所有碳源在10天内耗尽，乙酸、丁酸和己酸含量逐渐降低，pH值上升，表明在营养相对匮乏的固态系统中，CPBs优先进行生长而非己酸合成。

3.4.五批连续发酵过程中多维底窖泥原核群落演替模式

研究发现，Caproiciproducens在窖泥表层(0-1cm)呈现先略微下降后快速上升的趋势，从B1的3.37%增至B5的40.57%，接近老窖泥水平。而在深层窖泥(1-7cm)中，Caproiciproducens呈现先上升后下降的相反趋势。同时，乳酸杆菌快速减少，甲烷鬃菌(Methanoculleus)等协同菌属逐渐成为优势菌群。

3.5.多维底窖泥α多样性指数的演替模式

Simpson指数在原核群落多样性方面表现出明显的"先降后升"的双相变化模式，而Chao1指数在丰富度方面也显示出类似的阶段性特征。这种变化与CPBs丰度变化相一致，进一步支持了"双相"假说。

3.6.多维底窖泥β多样性的演替模式

NMDS分析显示，前三个批次(B1-B3)的微生物群落紧密聚集，后两个批次(B4-B5)则与老窖泥微生物群落表现出更强的亲和性，明显分为滞后相(lag phase)和老化相(aging phase)两个阶段。

3.7.五批连续发酵过程中多维窖泥理化性质的演替模式

在滞后相(B1-B3)，表层窖泥中乳酸显著积累，乙酸、丁酸和己酸含量略有下降，pH值和水分含量基本稳定。而在老化相(B4-B5)，乳酸含量逐渐降低，己酸含量下降，pH值逐渐上升。这种理化性质的阶段性变化与微生物群落演替模式相互印证。

3.8.Caproiciproducens与优势菌属及理化性质间Pearson相关性演替模式

在滞后相，Caproiciproducens与其他优势菌属的相关性较弱；进入老化相后，相关性迅速增强，与Aminobacterium、Lactobacillus等菌属形成强大的代谢网络。同时，Caproiciproducens与pH值的相关性从弱正相关转变为显著负相关。

3.9.五批连续发酵过程中多维底窖泥己酸合成功能预测

PICRUSt2预测显示，老化相(B4-B5)窖泥样本的己酸合成功能基因丰度与老窖泥更为接近，而滞后相(B1-B3)则更集中于乳酸降解和丁酸合成功能，表明两个阶段的代谢功能存在显著差异。

研究结论表明，通过接种自体CPBs丰富菌群，能够在一年内使四年窖泥的理化参数和原核群落结构接近四十年老窖泥水平，显著加速窖泥老化进程。提出的"滞后-老化双相"假说为理解窖泥老化机制提供了新视角：滞后相是微生物群落适应新环境的阶段，而老化相则是功能菌群建立稳定代谢网络的成熟阶段。

这项研究的重要意义在于首次从多维角度系统揭示了CPBs驱动窖泥老化的动态过程，建立了微生物群落演替与理化环境变化的关联模型。不仅为人工窖泥老化提供了可靠的技术路径，降低了CSFB生产对稀缺老窖泥资源的依赖，而且为复杂固态发酵系统中功能微生物的调控提供了理论指导。此外，黄水基质的CPBs发酵成本低廉，具有显著的经济效益和推广应用价值。未来结合宏基因组学、转录组学和酶动力学等多组学技术，有望进一步揭示CPBs在窖泥老化中的深层调控机制。