食品发酵中微生物功能解析：从传统组学到稳定同位素探测与单细胞测序的新策略

本研究针对自发发酵食品质量不稳定的核心难题——微生物功能认知不足，系统综述了从功能预测、单组学到多组学整合等传统方法在解析发酵微生物功能中的应用与局限，并重点探讨了稳定同位素探测(SIP)和单细胞测序(SCS)两种新兴技术在精准关联微生物分类单元与代谢功能方面的潜力，为实现发酵过程的精准调控提供了方法论指导。

　　

奶酪、白酒、泡菜、酸奶……这些深受人们喜爱的发酵食品，其独特的风味和品质背后，是复杂微生物群落协同作用的结果。然而，大多数传统发酵过程是自发进行的，依赖于环境中天然存在的微生物，这就导致了产品质量和产量的不稳定，给食品工业和消费者带来了不小的挑战。问题的根源在于，我们对这些驱动发酵过程的微生物的具体功能角色了解甚少。就像不了解每个队员技能的教练难以指挥球队赢得比赛一样，缺乏对微生物功能的深入认知，使得精准控制和优化发酵过程变得异常困难。

尽管高通量测序技术的发展让我们能够以前所未有的精度描绘出发酵体系中微生物的组成和多样性，但仅仅知道“谁在那里”还远远不够，关键在于弄清楚“它们正在做什么”。目前，基于扩增子测序的功能预测以及各种组学技术（宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学）仍是研究发酵微生物功能的主要手段。然而，这些方法产生的数据是群体平均水平，掩盖了微生物个体之间的功能异质性，也难以捕捉低丰度种群中关键功能贡献者的活动。这严重阻碍了我们真正理解微生物在发酵过程中的代谢贡献，特别是它们如何将营养底物转化为特定风味化合物的精确路径。

为了突破这些瓶颈，研究人员开始将目光投向在环境微生物学中已展现出强大威力的新兴技术——稳定同位素探测（Stable Isotope Probing, SIP）和单细胞测序（Single-Cell Sequencing, SCS）。SIP技术通过追踪稳定同位素（如¹³C、¹⁵N）标记的底物如何被微生物吸收并掺入其生物分子（如DNA、RNA），能够直接将微生物的分类身份与其特定的代谢功能联系起来，而无需预先了解其遗传或生化机制。SCS技术则通过对单个微生物细胞进行基因组、转录组等分析，揭示了群体内部的功能异质性，并能够阐明稀有类群和不可培养微生物的功能。尽管这两种技术在肠道、土壤等生态系统中取得了成功，但它们在食品发酵体系中的应用仍处于起步阶段。这篇发表在《Current Research in Microbial Sciences》上的综述文章，旨在系统梳理现有研究方法，并展望SIP和SCS技术在推动食品发酵微生物功能研究方面的巨大潜力，为最终实现发酵过程的精准设计和控制指明方向。

本研究主要涉及的关键技术方法包括：对传统微生物功能分析方法的评估，如基于标记基因（如16S rRNA）序列的功能预测工具PICRUSt，以及宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学等单组学和多组学整合策略；重点探讨了新兴的稳定同位素探测（SIP）技术，涉及¹³C或¹⁵N等标记底物的使用、密度梯度离心分离重/轻核酸以及后续的组学分析；详细介绍了单细胞测序（SCS）技术，涵盖单细胞分离（如微流控技术）、全基因组/转录组扩增和高通量测序。文中分析所涉及的发酵食品样本类型广泛，包括白酒（Baijiu）及其酒曲（Daqu）和窖泥（Pit mud）、奶酪（Cheese）、开菲尔（Kefir）、普洱茶（Pu'er tea）和大酱（Da-jiang）等来自世界不同地区的传统发酵产品。

2. 用于分析食品发酵中微生物群落功能的常规方法

当前研究发酵生态系统微生物功能的方法主要可分为三类：基于标记基因测序的功能预测、单组学技术和多组学整合策略。

2.1. 通过高通量标记基因测序进行功能预测

基于16S rRNA等标记基因的测序数据，利用PICRUSt等工具可以预测微生物群落的代谢功能。这种方法成本较低，适用于初步筛查，但其准确性严重依赖于数据库的完整性，而现有数据库往往偏向于医学或工业相关微生物，对发酵相关微生物的代表性不足，可能导致对未充分研究或未培养类群的功能注释错误。

2.2. 用于阐明微生物功能的单组学方法

单组学技术从不同分子层面提供 insights：

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  宏基因组学：直接对环境样本中的总DNA进行测序，无需培养即可获得群落的全部基因信息，能鉴定物种并预测功能潜力。其局限性在于无法区分基因是否表达、无法区分活菌与死菌，且低丰度物种容易被忽略。
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  宏转录组学：通过提取和分析信使RNA（mRNA）来揭示在特定环境下哪些基因被活跃转录，反映了微生物的实时活性。然而，从发酵基质中提取高质量RNA颇具挑战，且mRNA半衰期短，转录水平也不完全等同于蛋白质活性。
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  宏蛋白质组学：直接鉴定和量化微生物群落中的蛋白质，能提供酶活性、翻译后修饰等直接的功能证据。但其面临宿主蛋白背景干扰、蛋白质提取复杂以及数据库依赖性强等挑战。
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  代谢组学：检测、鉴定和量化小分子代谢物（<1500 Da），直接反映生物系统的生化状态和终点产物，对于理解风味形成至关重要。但其难点在于代谢物注释，缺乏全面的参考数据库。

2.3. 多组学整合

将多种组学数据（如宏基因组、宏转录组、代谢组）进行整合分析，可以提供从基因到代谢物的更全面的系统生物学视角，有助于构建微生物相互作用的代谢网络。例如，研究揭示了奶酪生产中微生物互作如何影响风味发育，开菲尔发酵中微生物通过顺序定植和代谢物交换实现稳定共存。然而，多组学整合仍面临数据整合的挑战，且群体平均数据会掩盖微生物异质性，也难以阐明稀有类群的功能。

3. 稳定同位素探测

稳定同位素探测（SIP）是一种强大的技术，能在不依赖培养的情况下，将微生物类群与其代谢功能直接关联。其基本流程包括：将稳定同位素（如¹³C-葡萄糖）标记的底物引入微生物群落；活性微生物吸收标记底物并将同位素掺入其生物分子（如DNA、RNA）；通过密度梯度离心（如使用氯化铯CsCl）分离被标记的“重”核酸和未标记的“轻”核酸；对“重”核酸部分进行高通量测序，从而识别参与特定底物代谢的活性微生物及其功能基因。

SIP技术已成功应用于环境微生物学领域，例如识别碳循环中的关键参与者、发现新的氮循环途径以及指导难培养微生物的分离。然而，将其应用于食品发酵体系面临诸多挑战：发酵食品基质复杂，含有多种碳氮源，难以追踪特定代谢流；微生物竞争可能导致同位素标记不均；高脂/高蛋白基质会干扰核酸提取和梯度分离；微生物生物量低且存在宿主DNA背景干扰；以及同位素在食品加工中的使用受到法规限制。此外，实验设计中还需注意避免同位素交叉喂养（次级消费者利用初级消费者的标记代谢物）和标记稀释，选择合适的生物标志物（DNA-SIP稳定性好，RNA-SIP时间分辨率高），并设置严格的对照（如灭活对照、未标记底物对照）以确保结果可靠。

尽管存在挑战，通过优化实验设计（如在实验室规模的模型系统中使用高度富集的同位素底物、进行脉冲追踪实验、优化核酸提取方法），SIP技术在食品发酵中具有巨大应用潜力。例如，它可以用于精准开发新型发酵剂：通过使用¹³C标记的特定风味前体物（如 citrate），SIP可以识别出负责消耗该前体并产生目标风味化合物（如 diacetyl）的关键微生物，进而将其分离并用于构建具有优良特性的合成发酵剂，实现发酵过程的精准调控。

4. 单细胞测序技术

单细胞测序（SCS）技术通过对单个细胞进行基因组、转录组等分析，克服了群体平均数据的局限性，能够揭示微生物群落内的功能异质性、鉴定稀有类群和未培养微生物的功能。其基本步骤包括：单细胞分离（如通过流式细胞分选、微流控技术）；核酸扩增（由于单细胞DNA/RNA量极少，需进行全基因组扩增WGA或全转录组扩增WTA）；高通量测序；生物信息学分析（如基因组组装、基因注释）。

SCS技术在解析复杂生态系统微生物功能方面已显示出强大能力。例如，在肠道微生物群研究中，无需参考基因组即可在物种水平识别对菊粉的代谢响应菌株；在瘤胃微生物组中，结合液滴单细胞RNA测序和泛基因组分析，揭示了物种内部的功能异质性，甚至重新定义了某些菌种的经典代谢认知。

然而，SCS在发酵生态系统中的应用仍待探索。与拥有丰富参考基因组的肠道微生物组相比，发酵食品中许多本土微生物缺乏高质量的参考基因组。此外，发酵食品的高脂/高蛋白基质对单细胞分离和扩增提出了技术挑战。发酵过程中微生物功能的动态变化也要求进行时间分辨的SCS分析。解决这些挑战的策略包括：结合长短读长测序改进基因组组装；为不同发酵基质建立标准化的单细胞分析流程；进行时间序列采样；以及开发单细胞稳定同位素探测等更强大的技术。通过克服这些障碍，SCS有望在发酵微生物组中发挥重要作用，揭示新的微生物功能，推动精准发酵的发展。

5. 食品发酵中微生物群落功能的研究进展

多种方法已被广泛应用于分析各类发酵食品中的微生物功能，以理解和管控其 microbiota。

5.1. 奶酪

奶酪发酵涉及来自发酵剂、原料乳、 adjunct 培养物和环境中的复杂微生物群落。多组学方法被用于研究微生物代谢与奶酪风味、质地、营养和安全等关键品质参数之间的关系。宏基因组学揭示了不同类型奶酪表皮微生物的假定功能基因和代谢途径。宏转录组学发现提高成熟温度可上调与蛋白水解、脂解和氨基酸/脂质分解代谢相关基因的表达，加速风味形成。多组学整合研究揭示了瑞士型奶酪在不同成熟条件下功能基因表达的差异，以及切达干酪生产中微生物菌株间通过竞争（如争夺 citrate）与合作（如提供氮源）相互作用共同塑造最终风味的机制。

5.2. 开菲尔

开菲尔是由开菲尔粒（包含乳酸菌、醋酸菌、酵母等）发酵牛奶制成的。宏基因组和泛宏基因组分析发现，尽管全球不同开菲尔样本的物种组成存在差异，但它们共享大量核心代谢途径，这可能是其产品风味品质一致的基础。通过结合宏基因组学、代谢组学、转录组学和物种互作图谱，研究人员揭示了开菲尔生态系统中原核生物和酵母通过顺序定植和代谢变化（早期定植者为后续物种提供氨基酸和乳酸等代谢物）来维持群落稳定性的时空动态机制。

5.3. 中国白酒

中国白酒（Baijiu）是利用酒曲（Daqu）为糖化发酵剂，在窖泥（Pit mud）中进行的自发固态发酵。宏转录组学是揭示白酒发酵过程中核心功能微生物及其风味形成代谢活动的主要手段。研究发现，在酱香型白酒发酵中，核心酵母负责初期高产乙醇，而乳酸菌则在后期产酸；在浓香型白酒发酵中，优势类群和关键类群均参与乙酸乙酯和高级醇的合成；控制酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的丰度是调控高级醇含量的潜在策略。

对酒曲的研究表明，其贡献了白酒发酵所需的大部分碳水化合物水解酶（如来自曲霉、根毛霉的淀粉酶和葡萄糖苷酶）。宏蛋白质组学发现，氨基酸代谢是导致不同颜色酒曲（如黄、白、黑曲）微生态分化的原因。温度是塑造酒曲微生物群落的关键驱动因素，宏转录组学分析表明，不同温度下活跃的微生物群落和功能酶存在显著差异，影响糖化发酵效率。

对窖泥的研究发现，随着窖龄增长，窖泥中产香功能微生物（如产甲烷菌和梭菌）更为丰富，与香气形成相关的功能蛋白表达更高，这有助于生产更高质量的白酒。对人工窖泥（APM）的多组学分析揭示了其批次发酵过程中原核生物分类和功能动态，为优化人工窖泥培养技术和提高白酒质量提供了依据。

5.4. 发酵茶

普洱茶（Pu'er tea）是通过固态发酵制成的。结合宏基因组学和宏蛋白质组学分析发现，在21天发酵期内，优势细菌为变形菌门（Proteobacteria），优势真菌为曲霉属（Aspergillus）。微生物分泌的胞外酶主要参与降解植物细胞壁多糖（如木聚糖、果胶、纤维素），促进茶叶软腐；同时，过氧化氢酶等酶催化儿茶素氧化。综合宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学揭示了普洱茶整个发酵过程的机制：发酵过程中，细菌和真菌群落结构发生演替；鉴定出的蛋白质主要涉及催化活性和代谢过程；大量的碳水化合物活性酶（CAZymes）负责降解植物和真菌多糖；代谢组学显示，酚类化合物含量下降，没食子酸等含量增加，这与苷键水解、酯类水解和氧化修饰有关，导致了茶叶口感从涩到醇的转变。

5.5. 发酵豆制品

对大酱（Da-jiang）发酵的研究表明，其细菌群落丰富，功能基因主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢等。真菌群落（如根霉、青霉）在早期生长并分泌各种酶，后期则依靠其酶继续作用。宏蛋白质组学发现根霉和青霉是碳水化合物降解的关键贡献者。宏转录组学分析将风味形成与核心微生物（如乳酸菌Lactobacillus和四联球菌Tetragenococcus）联系起来，揭示了这些微生物表达的关键酶与其产生的酸、醇、醛、酮等风味物质之间的直接关联。

6. 发酵中微生物功能分析的未来方向

未来研究有以下几个重要方向：

1. 1.
   发展和应用SIP与SCS技术：作为组学技术的补充，应大力发展并应用SIP和SCS来研究发酵体系中的微生物功能，以深入理解功能异质性和低丰度关键贡献者的作用。
2. 2.
   应用先进的培养策略：采用创新培养平台（如膜扩散培养iChip、微流控系统SlipChip、功能驱动分离如活细胞荧光原位杂交Live-FISH、拉曼激活细胞分选RACS等）来分离目前难以培养的发酵相关功能微生物，为构建用于可控发酵过程的合成群落奠定基础。
3. 3.
   结合计算生物学方法：将SIP和SCS与计算机模拟方法（如基因组尺度代谢模型）相结合。这些模型可以整合基因组数据预测微生物群落的代谢潜力和互作网络，进而战略性指导实验设计（如选择最佳同位素标记底物、锁定关键物种进行单细胞测序），形成假设驱动与数据驱动的研究闭环。

这些技术的融合将变革我们理解、预测和设计微生物群落的能力，从而发展出将传统发酵实践与现代系统生物学相结合的精准发酵系统，在实现先进过程控制的同时，保留手工产品的优良品质。

7. 结论

自发食品发酵的固有变异性往往导致产品不一致。为了实现稳定生产并保留理想特性，深入理解复杂微生物群落的功能角色至关重要。本综述批判性评估了当前解析发酵微生物功能的方法，指出了常规方法在解析功能异质性、个体微生物角色和低丰度关键贡献者方面的局限性。稳定同位素探测（SIP）和单细胞测序（SCS）等新兴技术在其他复杂生态系统中已证明其强大能力。通过针对性的适应和优化，这些先进方法在发酵系统中应用前景广阔。最终，对自发发酵中复杂微生物群落功能的全面阐明，将为合理设计合成微生物群落铺平道路。这种工程化的菌群有望实现对发酵过程的精确控制，确保生产的一致性和产品的优异质量，同时保持传统发酵食品的工艺特色。