肌肽通过调控泛素连接酶和氧化应激改善地塞米松诱导的肌肉萎缩

《Current Research in Toxicology》：Carnosine ameliorates dexamethasone-induced muscle atrophy with associated modulation of ubiquitin ligases and oxidative stress in C57BL/6J female mice

本研究聚焦于糖皮质激素地塞米松（Dex）诱导的肌肉萎缩这一临床难题，探讨了具有强抗氧化特性的二肽肌肽（Carnosine）的干预效果。研究人员通过体内实验发现，肌肽能显著缓解Dex引起的小鼠体重下降、肌肉重量减轻、肌纤维横截面积（CSA）缩小及肌球蛋白重链（MyHC）蛋白降解，并有效抑制Atrogin-1、MuRF1和Cbl-b等泛素连接酶的表达，降低氧化应激水平。该研究为肌肽作为防治药物性肌肉萎缩的潜在治疗策略提供了有力的实验依据，具有重要的转化医学价值。

　　

肌肉是维持人体生理功能的关键组织，肌肉萎缩——即肌肉质量和功能的下降——严重影响患者的健康和生活质量。多种生理和病理因素，如衰老、癌症、糖尿病、长期卧床、营养不良以及糖皮质激素（Glucocorticoid, GC）药物的使用，均可导致肌肉萎缩。地塞米松（Dexamethasone, Dex）作为一种强效且常用的糖皮质激素，因其抗炎和免疫抑制作用在临床上广泛应用，但长期或大剂量使用会引发包括肌肉萎缩在内的严重副作用。Dex通过与糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor, GR）结合，激活泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS），并上调肌肉特异性泛素E3连接酶MAFbx/Atrogin-1和肌肉环指蛋白-1（Muscle RING-finger protein-1, MuRF1）的表达，从而加速肌肉蛋白质的降解。此外，Dex诱导的肌肉萎缩与骨骼肌中的氧化应激密切相关。活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的积累会上调泛素连接酶Cbl-b（Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene-b），导致胰岛素受体底物-1（Insulin Receptor Substrate-1, IRS-1）被泛素化降解，进而损害胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1）信号通路，激活FoxO3a转录因子，最终诱导Atrogin-1和MuRF1的表达，加剧肌肉蛋白的分解代谢。因此，靶向氧化应激成为缓解Dex介导的肌肉萎缩的一个有前景的策略。

在此背景下，研究人员将目光投向了肌肽（Carnosine）。肌肽是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的天然二肽，在人体肌肉、心脏和脑组织中含量丰富。它以其强大的抗氧化、抗糖化、抗脂质过氧化以及pH缓冲能力而闻名，并显示出抗炎、抗衰老和神经保护等多种生物学活性。尽管此前有体外研究表明肌肽对肌肉细胞具有保护作用，但其在体内对肌肉萎缩的干预效果尚不清楚。为了填补这一空白，来自日本德岛大学的研究团队在《Current Research in Toxicology》上发表了他们的最新研究成果，深入探讨了肌肽对Dex诱导的雌性C57BL/6J小鼠肌肉萎缩的保护作用及其分子机制。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，建立了Dex诱导的肌肉萎缩小鼠模型，并给予为期21天的肌肽干预。其次，通过称重和组织学分析（苏木精-伊红染色）评估了肌肉重量和肌纤维横截面积（Cross-Sectional Area, CSA）的变化。第三，利用蛋白质免疫印迹（Western Blot）和自动化Western blot系统（如ProteinSimple? WES）检测了关键蛋白（如MyHC、Atrogin-1、MuRF1、Cbl-b、IRS-1、FoxO3a及其磷酸化形式、4-HNE）的表达水平。第四，通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）分析了相关基因（Atrogin-1、MuRF1、Cbl-b、SOD1、Catalase）的mRNA表达。最后，运用比色法测定了肌肉组织和血浆中的氧化应激标志物，包括丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和高级氧化蛋白产物（Advanced Oxidation Protein Products, AOPP）。所有数据均经过严格的统计学分析。

3.1. 肌肽对体重的影响

研究人员每日监测小鼠体重。结果显示，从第13天开始，单独使用Dex的小鼠体重显著下降，尤其在实验的第15至21天，与对照组相比差异最为明显。而同时给予肌肽和Dex处理的小鼠，其体重下降得到了显著缓解，体重恢复至接近对照组的水平。单独使用肌肽对小鼠体重没有产生显著影响。

3.2. 肌肽对肌肉重量的影响

研究人员测量了小鼠多种肌肉（腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌和比目鱼肌）的重量。Dex处理显著降低了所有这些肌肉的绝对重量。在将肌肉重量标准化为体重（肌肉重量/体重）后，发现Dex主要降低了腓肠肌和胫骨前肌的相对重量，而对趾长伸肌和比目鱼肌的影响不显著。肌肽与Dex共同处理显著改善了这些肌肉的绝对重量。对于相对重量，肌肽主要恢复了腓肠肌和胫骨前肌的损失，而对趾长伸肌和比目鱼肌的相对重量改善不明显。单独使用肌肽对肌肉重量无显著影响。

3.3. 肌肽对肌纤维横截面积的影响

通过对腓肠肌进行H&E染色和图像分析，研究人员评估了肌纤维横截面积（CSA）。Dex处理显著降低了肌纤维的平均CSA，并且肌纤维大小的分布显示，大尺寸纤维（1500–4000 μm²）的比例急剧减少，小尺寸纤维（500–1500 μm²）的比例增加。肌肽共同处理有效逆转了Dex引起的CSA减小，增加了大尺寸肌纤维的比例。

3.4. 肌肽对MyHC肌肉蛋白表达的影响

Western blot分析显示，Dex处理显著降低了腓肠肌中总MyHC蛋白的水平，而对快肌型和慢肌型MyHC蛋白的降低趋势未达到统计学显著性。重要的是，肌肽处理有效阻止了Dex引起的快肌型、慢肌型和总MyHC蛋白的下降。单独使用肌肽对MyHC蛋白水平无影响。

3.5. 肌肽对E3泛素连接酶mRNA和蛋白表达的影响

在基因水平上，实时荧光定量PCR结果显示，Dex处理显著上调了腓肠肌中Atrogin-1、MuRF-1和Cbl-b的mRNA表达。肌肽共同处理则显著抑制了Dex引起的这三种泛素连接酶mRNA的上调。在蛋白水平上，Western blot结果与mRNA结果一致：Dex显著增加了Atrogin-1、MuRF-1和Cbl-b的蛋白表达，而肌肽处理有效降低了这些蛋白的水平。单独使用肌肽对泛素连接酶的表达无影响。

3.6. 肌肽对IRS-1和FoxO转录因子的影响

研究人员进一步探讨了肌肽对IRS-1和FoxO3a信号通路的影响。Western blot分析表明，Dex处理显著降低了腓肠肌中IRS-1的蛋白水平。肌肽共同处理显示出恢复IRS-1表达的趋势，尽管与Dex单独处理组相比未达到统计学显著性（p = 0.06）。对于FoxO3a，Dex处理增加了总FoxO3a蛋白的表达，并降低了其磷酸化水平（P-FoxO3a），表明FoxO3a被激活。肌肽处理显著逆转了这些效应，降低了总FoxO3a水平，并提高了P-FoxO3a/总FoxO3a的比值，意味着FoxO3a的活性受到抑制。单独使用肌肽对IRS-1和FoxO3a无显著影响。

3.7. 肌肽对脂质过氧化和氧化应激的影响

为了评估氧化应激水平，研究人员检测了多个指标。Dex处理显著增加了腓肠肌中脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）的蛋白表达，以及肌肉组织和血浆中MDA和AOPP的水平。同时，Dex还上调了抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）和过氧化氢酶（Catalase）的mRNA表达，这可能是机体对氧化应激的一种代偿性反应。肌肽共同处理有效降低了4-HNE、MDA和AOPP的水平，并下调了SOD1和Catalase的mRNA表达，表明氧化应激状态得到缓解。单独使用肌肽对这些氧化应激参数无影响。

本研究得出结论，为期21天的肌肽补充能有效改善Dex诱导的小鼠肌肉萎缩。其保护机制主要与以下方面相关：肌肽通过其强大的抗氧化能力，显著降低了Dex引起的氧化应激，表现为脂质过氧化产物（4-HNE, MDA）和蛋白氧化产物（AOPP）水平的下降。氧化应激的缓解进而抑制了氧化应激敏感的泛素连接酶Cbl-b的上调，有助于维持IRS-1的稳定性。同时，肌肽通过促进FoxO3a的磷酸化（使其失活），抑制其核转位和转录活性，从而下调其下游靶基因Atrogin-1和MuRF1的表达。最终，这些分子事件的协同作用减少了肌肉蛋白质的泛素化降解，保护了肌纤维结构和收缩蛋白MyHC，维持了肌肉质量和功能。

这项研究的意义重大。它首次在体内模型中证实了肌肽对糖皮质激素诱导的肌肉萎缩具有明确的保护作用，并深入揭示了其通过调控氧化应激-Cbl-b-IRS-1-FoxO3a-Atrogin-1/MuRF1轴发挥作用的分子通路。鉴于肌肽具有良好的安全性（在动物和部分人体试验中均显示低毒性），这些发现为将肌肽开发成为一种辅助治疗策略，用于预防或减轻因长期使用糖皮质激素等药物引起的肌肉萎缩提供了强有力的 preclinical 证据。此外，该研究也为肌肽应用于其他肌肉消耗性疾病，如恶病质、衰老相关的肌少症等，提供了新的思路和理论依据。未来的研究需要进一步探索肌肽在人体中的长期疗效、最佳剂量以及更精确的作用机制，以推动其向临床应用的转化。