基于透射几何环境激光解吸与等离子体电离技术的脂质与核苷酸亚细胞质谱成像新方法

《Nature Communications》：Subcellular mass spectrometry imaging of lipids and nucleotides using transmission geometry ambient laser desorption and plasma ionisation

本研究针对当前质谱成像（MSI）技术在亚细胞分辨率下检测灵敏度不足的难题，开发了一种结合透射几何大气压基质辅助激光解吸电离（AP-t-MALDI）与冷等离子体电离（Plasma Ionisation）的新方法。通过预染色样品制备策略，脂质信号强度提升了一个数量级，并首次实现核苷酸的同步成像，在1μm像素尺度下检测到200余种脂质与核苷酸，分辨率可达250nm。该技术为空间生物学提供了强大的单细胞及亚细胞分子成像工具，推动了疾病机制与细胞异质性研究。

　　

在生命科学和医学研究中，理解细胞内部分子分布及其动态变化是揭示生理和病理机制的关键。然而，传统质谱成像技术受限于空间分辨率和检测灵敏度，难以在亚细胞水平对脂质、核苷酸等重要代谢物进行精准定位。尤其在高分辨率下，每个像素点所含样本量极少，电离效率低成为技术瓶颈。近年来，虽出现激光诱导后电离（MALDI-2）等改进策略，但结合微米/亚米级分辨率与广谱分析物检测仍具挑战。

为解决上述问题，澳大利亚伍伦贡大学Shane R. Ellis团队在《Nature Communications》发表研究，开发了一种新型透射几何大气压基质辅助激光解吸电离结合等离子体电离（AP-t-MALDI-P）技术，通过优化样品预处理方法，实现了脂质和核苷酸的高灵敏度亚细胞成像。

关键技术方法

研究采用透射几何激光解吸源，通过高数值孔径物镜将355nm激光聚焦至玻璃载玻片背面，利用压电平台实现纳米级移动控制。解吸后的中性分析物经加热毛细管导入SICRIT冷等离子体装置进行软电离，最终通过高分辨率质谱（timsTOF Pro）检测。样本制备中创新性引入预染色步骤：先使用甲酚紫（Cresyl Violet）对组织切片或细胞进行染色，再进行基质升华，显著提升激光解吸效率并缩小烧蚀坑直径至750nm。研究利用患者来源的循环肿瘤细胞系及小鼠脑组织、脊髓样本，结合荧光显微镜、扫描电镜（SEM）和聚焦离子束（FIB）等技术验证成像准确性。

研究结果

1. 预染色策略提升分析物检测效率

对比传统基质沉积方法，预染色使小鼠海马组织成像的脂质信号强度增强10倍，烧蚀坑尺寸从1.75μm降至750nm。FIB-SEM显示预染色组织中出现空腔化结构，表明激光能量更高效作用于样本内部。该方法首次在MSI中检测到质子化的阴离子脂质（如磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI），并在齿状回颗粒细胞中发现甲酚紫-嘌呤核苷酸复合物（m/z 342.123），证实核苷酸成像可行性。

2. 1μm像素尺度下的分析物覆盖度

通过对比三种基质（DHA、CHCA、DMACA），确定DMACA在1μm像素成像中信号强度最高。小鼠小脑次级裂区成像检测到191种脂质（白质区）和133种脂质（分子层），并清晰呈现嘌呤/嘧啶核苷酸的空间分布差异。例如，腺嘌呤核苷酸（A）和尿嘧啶核苷酸（U）定位于浦肯野神经元胞体，而脱氧核苷酸（如dA）富集于颗粒神经元。

3. 单细胞及亚细胞分析

在神经母细胞瘤（SH-SY5Y）和骨肉瘤（U2OS）细胞系中，2μm像素成像即可区分细胞核（核苷酸信号）与线粒体网络（脂质信号）。1μm分辨率下，脂质信号（如PC 34:2、PE 34:0）与线粒体荧光标记（MitoTracker）空间分布高度一致。对患者来源的循环肿瘤细胞（UWG01CTC、UWG02CTC等）进行共培养成像，发现不同细胞系间脂质谱差异，如UWG01CTC富集长链PC 36:1，而UWG02CTC偏好短链PC 32:1。

结论与意义

本研究通过AP-t-MALDI-P技术与预染色策略的结合，将质谱成像的空间分辨率推至亚微米级别（250nm），同时大幅提升脂质与核苷酸的检测灵敏度。该技术突破了传统MSI在单细胞及细胞器水平分子成像的局限，为空间生物学提供了多模态分析平台。未来通过整合荧光显微镜共定位与同位素标记等技术，有望进一步揭示细胞器互作及代谢动态，为疾病机制研究提供新视角。