沙芥PcHARBI1-5基因的鉴定及其作为非生物胁迫耐受性负调控因子的功能解析

《Gene》：Identification of PcHARBI1-5 in Pugionium cornutum reveals its negative involvement in tolerance to divergent abiotic stresses

本研究首次从沙芥（Pugionium cornutum）中鉴定出HARBI1基因家族成员PcHARBI1-5，通过拟南芥过表达和敲除实验证实该基因定位于细胞核，并作为负调控因子显著降低植物对干旱、盐、重金属（Cu2+/Cd2+）胁迫的耐受性，其机制与抑制抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、降低脯氨酸含量、加剧膜损伤和H2O2积累相关，为作物抗逆育种提供了新靶点。

　　

Section snippets

Plant materials

沙芥（Pugionium cornutum）种子采集自内蒙古自治区鄂尔多斯市毛乌素沙漠。拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型哥伦比亚-0（Col-0）种子由本实验室保存，突变体植株购自艾若莎生物技术有限公司。

Cultivation methods

沙芥种子去除外皮后，先用75%酒精浸泡30秒，然后用10% NaClO溶液处理10分钟进行表面消毒。消毒后用无菌水冲洗5-6次，播种于1/2 MS培养基上，在光照培养箱中于25°C、16小时光照/8小时黑暗条件下培养。

Physical and chemical properties analysis of PcHARBI1

基于实验室先前获得的沙芥转录组数据（Wu, 2024），对PcHARBI1进行了生物信息学分析，共鉴定出13个具有完整开放阅读框（ORF）的DDE家族基因。按数字顺序将其命名为PcDDE1-13（表S2）。对PcDDE1-13编码的13种蛋白质的理化性质进行分析，结果预测其等电点（pI）范围为5.18（PcDDE12）至8.78（PcDDE9），分子量范围为40.21 kDa（PcDDE6）至78.74 kDa（PcDDE13）。所有蛋白质均被预测为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示，大多数PcDDE蛋白主要位于细胞核中。

Discussion

近年来，新一代测序技术，特别是高通量RNA测序（RNA-Seq），已被广泛应用于研究植物对非生物胁迫的转录组响应。比较转录组分析能够识别和功能表征与这些胁迫响应相关的差异表达基因（DEGs）。本研究通过对干旱胁迫下的沙芥进行转录组分析，鉴定出13个PcHARBI1基因家族成员。表达模式分析表明，PcHARBI1-5在根和叶中均显著下调，暗示其可能作为负调控因子参与胁迫响应。在拟南芥中的功能验证结果表明，过表达PcHARBI1-5会降低种子萌发率和抑制根生长，并导致关键的生理指标恶化，包括抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性降低、脯氨酸含量减少、膜损伤加剧以及H₂O₂积累增加。相反，敲除其拟南芥同源基因则增强了胁迫耐受性。这些发现与在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和苹果（Malus domestica）等其他物种中报道的HARBI1基因功能一致，进一步支持了HARBI1蛋白在植物胁迫响应中的保守作用。然而，PcHARBI1-5具体的下游靶基因和调控网络仍有待进一步探索。

Conclusion

(1) 本研究利用转录组数据鉴定出13个PcHARBI1基因家族成员，并分析了它们在盐、干旱、高温、低温、Cd²⁺和Cu²⁺胁迫条件下的表达模式。

(2) 筛选并克隆了PcHARBI1-5基因。亚细胞定位表明PcHARBI1-5基因主要位于细胞核中。

(3) 基础生理分析表明，在拟南芥中过表达PcHARBI1-5基因降低了其对干旱、盐和重金属（Cu²⁺、Cd²⁺）胁迫的耐受性。