农杆菌介导的棉花根系器官发生与开放处理系统(AgroROOTs)：根系功能基因组学研究的新突破

《Industrial Crops and Products》：Agrobacterium-mediated root organogenesis and open treatment system (AgroROOTs) for root functional genomics studies in cotton

本研究针对棉花根系功能研究技术瓶颈，开发了不依赖组织培养的农杆菌介导根系器官发生与开放处理系统(AgroROOTs)。通过优化发根农杆菌K599菌株转化参数和真空处理，将转基因毛状根诱导效率提升至33.3%，并建立了基于rolABC基因的Ri独立转化体系。该系统成功应用于CRISPR/Cas9基因组编辑和病毒介导的基因开关研究，为棉花根系生物学研究提供了高效平台。

　　

在棉花生物学研究领域，一个长期存在的矛盾日益凸显：虽然根系作为作物吸收水分养分、抵抗逆境的核心器官，其功能研究却远远滞后于地上部分。这种不平衡主要源于技术瓶颈——传统根系研究方法往往需要复杂的组织培养体系，操作繁琐且效率低下，特别是对于棉花这类转化难度较大的作物。更棘手的是，现有发根农杆菌介导的毛状根转化系统产生的根系多为气生根，难以模拟真实土壤环境中根系的生理功能，这严重限制了根系功能基因组学研究的深入开展。

面对这一挑战，郑州大学研究人员在《Industrial Crops and Products》上发表了创新性研究成果，他们开发了一套名为AgroROOTs（农杆菌介导的根系器官发生与开放处理系统）的全新技术平台。这项研究突破了传统方法的局限，为棉花根系研究带来了革命性的变革。

研究人员采用了一系列关键技术方法：首先优化了发根农杆菌K599菌株的转化参数，包括菌液浓度(OD₆₀₀=0.7)、苗龄(8天)和湿度条件；建立了真空渗透法进行高通量转化；利用来自Ri质粒的rolABC基因开发了Ri独立转化系统；采用水培培养体系进行转基因根系的长期维持；并整合了CRISPR/Cas9基因组编辑技术和烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因传递系统。

3.1. 发根农杆菌介导的土壤生长棉花下胚轴毛状根转化

通过比较六种发根农杆菌菌株，发现K599在去除主根的下胚轴中诱导效率最高(26.6%)，成功建立了土壤条件下直接诱导转基因毛状根的方法。

3.2. 转基因毛状根诱导的优化

系统优化了转化参数，确定最佳菌液浓度为OD₆₀₀=0.7，最佳苗龄为8天，高湿度条件显著提高诱导效率至30%。

3.3. 真空渗透介导的高通量毛状根诱导

真空处理2分钟(0.7MPa)将转化效率提升至33.3%，并在多个棉花品种中验证了该方法的基因型独立性。

3.4. 使用rolABC的Ri独立毛状根生产

利用rolABC基因成功在 disarm的发根农杆菌18r12和根癌农杆菌EHA105、GV3101中诱导Ri独立毛状根，避免了Ri综合征的影响。

3.5. 转化根系的水培培养和增殖

建立的水培系统支持转基因毛状根的长期生长，可通过修剪野生型根或抗生素选择富集转基因根系，并支持植株完成整个生命周期。

3.6. CRISPR-Cas9介导的AgroROOTs基因编辑

在毛状根中实现GhBASS5基因编辑，sgRNA2在A、D亚基因组中的编辑效率分别达到83%和86%，与稳定转基因株系的编辑特征高度一致。

3.7. AgroROOTs中病毒介导的基因开关和转基因删除

利用TRV病毒载体将Cre重组酶从地上部传递至根系，成功实现rolABC基因的删除和RUBY报告基因的激活，证明病毒在根-冠信号传导中的应用潜力。

3.8. AgroROOTs促进的根系分泌物研究

水培系统中检测到转基因根系分泌的甜菜素含量达63.3ng/mL，代谢组学分析鉴定出3209种代谢物，揭示了转基因对根系分泌物组成的显著影响。

研究结论与讨论部分强调，AgroROOTs系统成功解决了棉花根系功能研究的技术瓶颈。与传统方法相比，该系统具有三大突出优势：完全非无菌操作提高了可扩展性；水培体系实现转基因根系精准富集；开放培养条件便于实时观测和处理。更重要的是，该系统兼容多种前沿生物技术，包括CRISPR/Cas9基因组编辑、病毒介导基因传递和代谢组学分析，为棉花根系生物学研究提供了多功能平台。

该研究的创新性体现在多个方面：首次在棉花中建立土壤条件下直接诱导生理相关性毛状根的方法；开发了基于rolABC的Ri独立转化系统避免发育异常；整合病毒载体实现根际定向基因操作。特别值得关注的是，该系统在根系分泌物研究方面展现出独特价值，为根际微生物互作研究提供了新思路。

AgroROOTs平台的建立不仅推动了棉花根系功能基因组学研究，其技术原理和方法学创新对其它作物根系研究也具有重要借鉴意义。未来，这一平台可用于解析棉花抗逆机理、优化根系构型、研究根际微生物互作等多个方向，为棉花遗传改良和农业生产提供理论支持和技术支撑。随着该技术的不断完善和推广应用，有望成为作物根系研究的标准化平台，推动植物根系生物学研究进入新的发展阶段。