低共熔溶剂介导柑橘多甲氧基黄酮去甲基化：工艺优化、生物活性提升与可持续转化策略

《Industrial Crops and Products》：Deep eutectic solvent-mediated demethylation of citrus polymethoxyflavones: Effects, optimization, and bioactivity evaluation

本研究针对传统柑橘多甲氧基黄酮(PMFs)去甲基化方法存在的效率低、污染重等问题，开发了一种基于胆碱氯化物/柠檬酸低共熔溶剂(DES)的微波辅助绿色转化新工艺。研究系统优化了关键参数，实现了高达96.32%的PMFs向5-羟基-PMFs (5-OH-PMFs)的高效转化，并证实5-OH-PMFs具有显著增强的抗氧化和抗炎活性。该策略为从农业废弃物中高值化制备高生物活性天然产物提供了新途径。

　　

柑橘，作为全球广泛种植的水果，其加工过程中产生的大量果皮常被视为废弃物。然而，这些“废弃物”实则蕴藏着宝藏——多甲氧基黄酮(Polymethoxyflavones, PMFs)。PMFs是柑橘中一类特征性的黄酮类化合物，研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗癌、调节脂质代谢等多种生物活性。但一个关键的科学问题限制了其应用：PMFs在体内的真正活性形式是其去甲基化产物，即5-羟基多甲氧基黄酮(5-Hydroxy-polymethoxyflavones, 5-OH-PMFs)。5-OH-PMFs因其结构中引入了极性更强的羟基，其生物利用度和生物活性通常显著优于其母体PMFs。

因此，如何将PMFs高效、绿色地转化为5-OH-PMFs，成为提升柑橘资源价值的关键。传统的转化方法，如使用三溴化硼(BBr₃)等试剂，存在毒性大、条件苛刻、后处理产生危险废物等问题；而盐酸加热回流法则耗时长达24小时，且盐酸具有腐蚀性和挥发性，操作安全性差；食用级磷酸酸体系虽安全性较高，但仍需在175℃下反应2小时，且转化率和产物纯化方面仍有提升空间。这些方法的局限性阻碍了PMFs绿色生产的实现。近年来，低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents, DES)作为一种新型绿色溶剂，因其低毒、可生物降解、易制备、可设计等优点而受到广泛关注。DES在提取天然产物的同时能催化其结构转化的特性，为PMFs的绿色转化带来了新的希望。然而，DES在PMFs去甲基化这一特定反应中的应用潜力尚不明确。

为解决上述问题，西南大学的研究团队在《Industrial Crops and Products》上发表了题为“Deep eutectic solvent-mediated demethylation of citrus polymethoxyflavones: Effects, optimization, and bioactivity evaluation”的研究论文。该研究旨在探索利用DES高效催化柑橘PMFs去甲基化，制备高生物活性5-OH-PMFs的可行性，并系统评估其工艺条件、溶剂回收性能及产物的生物活性。

为开展此项研究，研究人员运用了几项关键技术方法：首先，从柑橘皮中通过石油醚回流提取和甲基叔丁基醚洗涤的两步法富集高纯度PMFs混合物。其次，合成并表征了六种不同氢键供体（包括羧酸类、醇类和酰胺类）的DES，系统分析了其理化性质。接着，采用微波辅助、高温高压及超声浴等多种物理强化技术处理PMFs与DES的混合物，筛选最优转化体系。然后，通过单因素实验优化了微波功率、料液比、反应时间等关键工艺参数。最后，利用细胞模型（RAW264.7巨噬细胞）和化学法评价了5-OH-PMFs的抗氧化、抗炎活性，并通过体外模拟胃肠消化模型评估了其生物可及性。

3.1. 柑橘PMFs的富集分析与DES的合成表征

研究人员首先从柑橘皮中成功富集了高纯度的PMFs混合物，经鉴定主要包含诺比列汀(Nobiletin, NOB)、川陈皮素(Tangeretin, TAN)、异甜橙黄酮(Isosinensetin, ISO)和甜橙黄酮(Sinensetin, SIN)，其中NOB和TAN含量最高，合计占比超过87%。随后，他们成功合成了六种DES，并通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、热重分析(TGA)等手段证实了DES的形成及其热稳定性。理化性质表征显示，羧酸类DES（如ChCl/OA, ChCl/CA）具有强酸性、高粘度及较高的Kamlet-Taft α参数（氢键酸度），这些特性与其催化性能密切相关。

3.2. DES及加工方法对PMFs去甲基化的影响

DES类型筛选结果表明，只有羧酸类DES（ChCl/OA, ChCl/CA）能有效催化PMFs去甲基化生成5-DN和5-DT，而醇类和酰胺类DES则无此效果，凸显了酸性环境对反应的必要性。加工方法比较发现，微波和高温高压处理能有效促进反应，而超声浴处理效果不佳，强调了热能输入对启动反应的重要性。相关性分析进一步揭示，DES的pH值、粘度、Kamlet-Taft α参数与转化效率(Conversion Efficiency, CE)呈显著负相关或正相关，而π*参数（极性）与CE呈负相关，表明DES的强氢键酸性和适当的极性有利于PMFs的转化。

3.3. 转化工艺参数的优化

以ChCl/CA (DES2)为模型溶剂进行工艺优化。结果表明，DES体系中水分含量对转化效率影响极大，无水条件下效率最高（85.49%），添加5%水即导致效率急剧下降，因水分子破坏了DES固有的氢键网络。较低的料液比（1:5 g/L）有利于底物与溶剂的充分接触。微波功率为480 W时转化效率最高（90.47%），过高功率（800 W）可能导致PMFs降解。反应时间10分钟时达到最佳转化效率（96.32%）。最终在优化条件下（料液比1:5 g/L，微波功率480 W，时间10 min），ChCl/CA体系实现了96.32%的高效转化。DES回收实验表明，经过四次循环使用后，其转化效率仍能保持在75%以上，显示了良好的可重复使用性。

3.4. 与传统方法的比较

与传统的BBr₃法、盐酸回流法及磷酸酸法相比，本研究开发的DES-微波辅助法在反应时间（10分钟 vs 2-24小时）、条件温和度、环境友好性及操作安全性方面均展现出显著优势，且转化效率高达96.32%，为PMFs的绿色高效转化提供了更具竞争力的方案。

3.5. 5-OH-PMFs的生物活性评价

化学抗氧化活性评价（ABTS、DPPH、FRAP法）显示，5-OH-PMFs的抗氧化能力极显著高于PMFs。在RAW264.7细胞模型中，5-OH-PMFs能更有效地缓解H₂O₂诱导的氧化应激，显著降低丙二醛(MDA)含量，并提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性和谷胱甘肽(GSH)水平。在抗炎活性方面，5-OH-PMFs在LPS诱导的炎症模型中表现出比PMFs更强的抑制一氧化氮(NO)产生的能力，并能更有效地调控炎症因子表达，即上调抗炎因子（TGF-β, IL-10），下调促炎因子（IL-6, IL-1β, TNF-α）。体外模拟胃肠消化实验表明，5-OH-PMFs（特别是5-DN）在肠道阶段的溶解度显著高于其对应的PMFs（如NOB），提示其可能具有更好的生物可及性。

结论与意义

本研究成功开发了一种基于胆碱氯化物/柠檬酸低共熔溶剂(DES)的微波辅助绿色技术，用于高效催化柑橘多甲氧基黄酮(PMFs)的去甲基化反应，制备高生物活性的5-羟基多甲氧基黄酮(5-OH-PMFs)。研究明确了DES的酸性、氢键强度、Kamlet-Taft参数等是影响转化效率的关键因素。在优化条件下，该技术实现了高达96.32%的转化率，且DES可循环使用多次。更重要的是，研究证实了5-OH-PMFs相较于PMFs具有显著增强的抗氧化和抗炎活性，以及可能改善的生物可及性。

该研究的重要意义在于：首先，它为解决传统PMFs去甲基化方法存在的效率低、污染重、条件苛刻等问题提供了一种创新、绿色、高效的替代方案。其次，该策略实现了从柑橘加工副产物（果皮）向高附加值生物活性成分的可持续转化，符合绿色化学和农业废弃物高值化利用的原则。最后，所获得的5-OH-PMFs因其卓越的生物活性，在功能性食品、膳食补充剂以及预防或辅助治疗氧化应激和炎症相关疾病的新型药物先导化合物开发方面展现出广阔的应用前景。这项研究不仅为柑橘资源的深度开发提供了新的技术路径，也为利用DES设计定制化催化体系用于其他天然产物的结构修饰与活性提升提供了有价值的理论参考和实践范例。