苯扎氯铵诱导副溶血弧菌生物膜增殖与VBNC状态形成的机制研究——独立于消毒剂抗性组的发现

《International Journal of Food Microbiology》：Increased biomass and viable but non-culturable state following benzalkonium chloride exposure in Vibrio parahaemolyticus biofilm, independent of the disinfectant resistome

本研究针对食品工业中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)生物膜对季铵盐消毒剂苯扎氯铵(BAC)的耐受机制问题，通过全基因组测序和生物膜模型揭示了qacEΔ1基因的独特作用：该基因阳性菌株通过主动外排降低基质过度产生，而阴性菌株则通过增加生物膜基质抵抗消毒剂渗透。研究发现工业浓度BAC(375 μg/mL)无法彻底清除生物膜且主要诱导 viable but non-culturable (VBNC)状态，为食品工业消毒策略的优化提供了关键理论依据。

　　

在食品加工环境中，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)凭借其卓越的生物膜形成能力，成为难以根除的潜在致病源。这种附着于设备表面的菌群结构不仅增强了细菌对常规消毒剂的耐受性，更棘手的是，它们可能在消毒剂压力下进入可存活但不可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态，如同进入"休眠模式"，逃避常规检测却仍具潜在致病风险。季铵盐类消毒剂如苯扎氯铵(benzalkonium chloride, BAC)在食品工业中广泛应用，但日益突出的生物膜耐受问题促使研究者深入探索其分子机制。传统研究多聚焦于耐药基因组(resistome)的作用，而由Antoine Régnier等人发表于《International Journal of Food Microbiology》的研究则突破常规，揭示了独立于抗性组之外的适应性机制。

为系统解析副溶血弧菌对BAC的耐受机制，研究团队整合了多项关键技术：首先对39株副溶血弧菌临床分离株进行长短读长结合的全基因组测序(whole-genome sequencing)，精准注释耐药基因；通过最小生物膜清除浓度(minimal biofilm eradication concentration, MBEC)实验评估BAC对生物膜的清除效果；结合qPCR、PMA-qPCR（基于叠氮溴化丙锭的定量PCR）和菌落计数等多重技术，定量分析生物膜中活菌、死菌和VBNC状态细胞的分布比例；同时利用基因组比对和系统进化分析追踪qacEΔ1基因的进化来源与定位特征。

研究结果揭示了多个重要发现：

1. 1.
   抗性组特征分析
   通过全基因组测序发现，39株菌株共携带21个抗生素耐药基因(antimicrobial resistance genes, ARGs)，其中19个属于耐药结节化细胞分化(resistance nodulation cell division, RND)外排泵家族基因，另有vmrA基因（多药和毒性化合物外排转运蛋白家族）。这些基因均高度保守且位于染色体上，提示其稳定的遗传特性。
2. 2.
   qacEΔ1基因的首次发现
   研究首次在副溶血弧菌染色体中检测到qacEΔ1基因，该基因编码小多重耐药(small multidrug resistance, SMR)外排泵，与季铵盐化合物耐药性直接相关。基因定位分析显示其邻近可移动遗传元件（约20kbp区域），表明该基因可能通过水平基因转移在不同菌株间传播。
3. 3.
   生物膜对BAC的响应机制
   BAC清除实验表明，qacEΔ1阴性菌株在亚抑制浓度BAC暴露下生物膜生物量显著增加，而阳性菌株无此现象。进一步分析显示，生物膜由约20%死菌、约80%VBNC细胞以及富含胞外DNA的基质组成。研究者推测，qacEΔ1阴性菌株通过过度产生基质物理阻隔消毒剂渗透，而阳性菌株则依赖主动外排机制降低BAC摄入，但能量代谢成本可能影响生物膜发育。
4. 4.
   VBNC状态诱导效应
   在工业常用BAC浓度（375 μg/mL）作用下，所有菌株均显著诱导VBNC状态形成，且单纯化学消毒无法彻底清除生物膜，必须结合机械清洗才能有效去除。

本研究系统阐明了副溶血弧菌生物膜耐受BAC的双重机制：qacEΔ1基因介导的主动外排与基质过度产生的物理屏障作用。特别值得注意的是，BAC在工业应用浓度下不仅无法有效清除生物膜，反而会诱导VBNC状态形成，这为食品安全生产敲响了警钟。研究结果强调，现行以化学消毒为主的策略必须结合机械干预，才能实现对微生物风险的全面控制。该发现不仅深化了对细菌适应性机制的理解，更为食品工业消毒规程的优化提供了关键科学依据，对保障食品安全具有重要实践意义。