孟德尔随机化揭示免疫细胞表型与糖尿病视网膜病变遗传易感性的因果关联

《Medicine》：Effect of evidence-based nursing supervision on hemodialysis patients with chronic kidney failure

本综述采用孟德尔随机化（MR）方法，首次系统评估731种免疫细胞表型对糖尿病视网膜病变（DR）的因果效应，发现11种免疫细胞（包括T细胞、NKT细胞、树突状细胞等）与DR遗传易感性显著相关，为DR的免疫机制研究和靶向治疗提供新视角。

　　

引言

糖尿病视网膜病变（DR）是由慢性持续性高血糖引起的视网膜微血管病变，是全球视力丧失的主要原因。流行病学数据显示，2017年全球约4.51亿人患有糖尿病，预计到2045年将增至6.93亿。DR在糖尿病患者中的患病率高达22.27%，其主要临床表现包括视力模糊、飞蚊症、视物变形，甚至部分或完全失明，严重影响患者生活质量。尽管抗血管内皮生长因子、激光光凝和玻璃体内注射类固醇等治疗方法在一定程度上缓解了DR，但其疗效仍有限。因此，深入理解DR的发病机制对于探索潜在靶点和药物至关重要。

既往研究表明氧化应激、氨基酸代谢和糖化血红蛋白水平等因素与DR相关。随着研究的深入，炎症和免疫反应在DR发病机制中的作用日益受到关注。已有研究揭示DR患者某些免疫细胞存在表型改变，但当前研究多聚焦于特定免疫细胞，缺乏对多种免疫细胞的全面解析，且主要为横断面研究，难以有效评估免疫细胞与DR之间的因果属性。孟德尔随机化（MR）作为一种遗传流行病学方法，利用遗传变异作为工具变量评估暴露对结局的因果效应，与传统研究方法相比，不易受到反向因果关系、选择性偏倚和混杂因素的影响。

材料与方法

研究设计

本研究基于MR的三项基本假设（关联性、独立性和排他性）进行设计，确保研究的科学严谨性。关联性假设要求单核苷酸多态性（SNP）与暴露因素强相关；独立性假设要求SNP独立于混杂因素；排他性假设要求SNP仅通过暴露因素影响结局，而非通过其他途径。

数据来源

免疫细胞数据（编号GCST0001391至GCST0002121）来自欧洲生物信息学研究所（EBI），源自一项对3757名撒丁岛居民的研究，分析了约2200万个变异对731种免疫细胞特征的影响，包括118种绝对细胞计数、389种表面抗原平均荧光强度、32种形态学参数和192种相对计数。DR数据（编号finngen_R9_DM_RETINOPATHY_EXMORE）来自FinnGen数据库，该数据库提供了319,046名欧洲人的DR全基因组关联研究（GWAS）数据，其中实验组10,413人，对照组308,633人。

遗传工具变量选择

首先，限制P < 5 × 10^–6筛选与每种免疫细胞表型密切相关的SNP；其次，限制R² < 0.001和kb = 10,000筛选独立SNP以排除连锁不平衡干扰；第三，限制F > 10筛选强相关SNP以排除弱工具变量偏倚；第四，通过PhenoScanner和Google Scholar排除含混杂因素的SNP；第五，在调整暴露和结局的等位基因方向时，根据效应等位基因频率排除不匹配的SNP；第六，使用MR-Pleiotropy Residual Sum and Outlier方法排除显著偏倚的SNP（P < .05），确保因果推断的正确性。

数据分析

使用STROBE-MR作为方法学指导。采用R 4.3.1软件和TwoSampleMR程序包进行MR分析。逆方差加权（IVW）作为主要评估方法，加权中位数法和MR-Egger回归作为次要评估方法。MR-Egger还用于评估水平多效性（要求P ≥ .05）。采用Cochran Q检验和留一法分别评估异质性和敏感性。

结果

两样本MR分析

MR分析鉴定出11种与DR遗传易感性增加相关的免疫细胞表型。其中4种T细胞相关表型：CD4 on resting Treg（OR 1.117，95% CI 1.026–1.216，P = .011）、CD4/CD8br（OR 1.118，95% CI 1.013–1.236，P = .027）、CD28+ CD45RA? CD8dim AC（OR 1.013，95% CI 1.003–1.022，P = .009）和CD28? CD25++ CD8br %T cell（OR 1.121，95% CI 1.012–1.241，P = .028）。2种NKT细胞相关表型：CD8br NKT AC（OR 1.407，95% CI 1.007–1.966，P = .046）和CD3 on NKT（OR 1.091，95% CI 1.008–1.181，P = .031）。3种树突状细胞相关表型：CD80 on plasmacytoid DC（OR 1.050，95% CI 1.009–1.092，P = .016）、CD80 on CD62L+ plasmacytoid DC（OR 1.050，95% CI 1.009–1.092，P = .016）和CD80 on myeloid DC（OR 1.060，95% CI 1.012–1.109，P = .013）。1种单核细胞相关表型：HLA DR on CD33br HLA DR+ CD14?（OR 1.063，95% CI 1.019–1.110，P = .005）和1种髓系细胞相关表型：CD33? HLA DR? AC（OR 1.066，95% CI 1.022–1.112，P = .003）。MR-Egger回归未检测到水平多效性（P ≥ .05）。

异质性与敏感性分析

Cochran Q检验显示，除CD8br NKT AC（P < .001）和HLA DR on CD33br HLA DR+ CD14?（P = .002）外，其余结果均无异质性（P ≥ .05）。敏感性分析表明所有结果均稳健。

讨论

本研究首次通过MR分析全面评估了731种免疫细胞表型对DR的因果效应，发现11种免疫细胞表型与DR遗传易感性增加相关。这些表型指向树突状细胞、CD80、CD62L、NKT细胞、CD3、CD8、CD4、Treg、HLA DR和CD33等在DR发病中的潜在作用。

树突状细胞相关表型（CD80 on plasmacytoid DC、CD80 on CD62L+ plasmacytoid DC、CD80 on myeloid DC）提示树突状细胞、CD80和CD62L与DR风险相关。浆细胞样树突状细胞作为树突状细胞的特化亚群，具有抗原呈递功能，参与T淋巴细胞反应、免疫调节、浆细胞分化和抗体分泌。髓系树突状细胞具有独特的抗原呈递功能，通过向T细胞呈递抗原并提供共刺激信号来调节免疫反应。动物研究表明，链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠髓系树突状细胞分泌更多白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α等促炎因子，提示树突状细胞可能参与糖尿病及其并发症的慢性炎症过程。CD80主要表达于树突状细胞、B细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞表面，通过与CD28结合传递第二信号，参与T细胞的活化与增殖。CD62L（L-选择素）是一种I型跨膜糖蛋白和细胞粘附分子，对介导白细胞粘附和迁移至关重要。多项临床研究显示，DR患者血清L-选择素水平显著高于非糖尿病人群和单纯2型糖尿病（T2D）患者，表明L-选择素可能在DR发病中发挥重要作用。

NKT细胞相关表型（CD8br NKT AC、CD3 on NKT）中，NKT细胞是一类具有先天和适应性免疫特征的特殊淋巴细胞，通过分泌细胞因子调节炎症反应和免疫反应，并直接杀伤肿瘤细胞和感染病原体。尽管尚无直接证据证实NKT细胞与DR的关系，但既往研究发现新发T2D患者NKG2D+ NK细胞和NKT细胞频率显著高于健康人群，提示NKT细胞在糖尿病及其并发症中可能发挥作用。CD3是一种跨膜信号蛋白，通过结合T细胞受体传递外部抗原信号并调节T细胞功能。临床研究显示，活动性增殖性DR纤维血管膜中CD3+细胞数量显著高于静止性增殖性DR，表明CD3与DR的活动期相关。CD8是T细胞表面标志物，对免疫细胞识别和杀伤感染细胞至关重要。动物实验发现糖尿病小鼠骨髓和脾脏组织中干扰素-γ+ CD8 T细胞频率显著增加；临床研究也显示T2D患者结膜中CD8+细胞百分比显著高于健康人群，提示CD8可能通过促进糖尿病进展而增加并发症风险。

T细胞相关表型（CD4 on resting Treg、CD4/CD8br）中，初始CD4+ T细胞与抗原-主要组织相容性复合物结合后分化为Th1、Th2和Treg等亚型，从而调节先天性和适应性免疫。临床研究表明，非增殖性DR和增殖性DR患者外周血CD4+ CXCR5+ PD-1+ Tfh细胞百分比显著高于健康组；活动性增殖性DR纤维血管膜中CD4+细胞数量也显著增加，支持CD4+ T细胞与DR及其活动期的关联。Treg作为CD4+ T细胞的主要亚型之一，在糖尿病及其并发症中发挥作用。研究显示新发1型糖尿病（T1D）儿童常规Treg细胞频率高于自身抗体阴性儿童；T2D患者Foxp3-CD4T细胞和Foxp3+ Treg细胞中白细胞介素-17表达水平显著高于非T2D患者，表明Treg细胞参与T1D和T2D的发病机制。鉴于糖尿病是DR最重要的危险因素，可推断Treg细胞可能在DR发病中起作用。此外，T2D患者结膜中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞百分比均显著高于健康人群，支持CD4/CD8br作为DR危险因素。

单核细胞和髓系细胞相关表型（HLA DR on CD33br HLA DR+ CD14?、CD33? HLA DR? AC）中，HLA DR是一种主要组织相容性复合体II类分子，主要存在于抗原呈递细胞表面。病例对照研究显示，非增殖性DR患者HLA-DR7频率显著高于健康人群；横断面研究发现增殖性DR患者HLA-DQ4和HLA-DR4/HLA-DQ4单倍型频率显著高于无DR患者，提示HLA-DR参与DR发病。CD33主要表达于髓系细胞，与T2D发病机制相关。研究显示T2D患者CD33+ HLA-DR?/low单核髓系来源抑制细胞频率高于普通人群；另一研究也发现T2D患者外周血CD11b+/CD33+ MDSCs频率增加，支持HLA DR和CD33与DR的直接或间接关联。

其他T细胞表型（CD28+ CD45RA? CD8dim AC、CD28? CD25++ CD8br %T cell）中，CD28主要表达于活化T细胞，调节T细胞增殖和分化。研究发现CD28基因rs1879877和rs3181096与T1D风险增加相关，提示CD28可能参与T1D发病。CD25（白细胞介素-2受体α链）在调节Treg和效应T细胞以及细胞凋亡中起重要作用。临床研究显示T1D患者sCD25水平显著升高；新发T1D患者CD25+ MAIT细胞频率显著高于正常人群，表明CD25与糖尿病风险相关。

本研究结果与既往证据一致，支持树突状细胞、T细胞和NKT细胞与DR风险的关联，突出了慢性低度炎症和免疫失调在糖尿病视网膜血管损伤中的作用。独特之处在于，本研究鉴定了增加DR遗传易感性的特定免疫细胞表型，为生物标志物和治疗靶点的开发提供了宝贵见解。为增强这些发现的转化相关性，未来研究应优先在特征明确的糖尿病队列中验证，包括治疗和未治疗人群。纵向队列研究或随机对照试验中的巢式病例对照设计可评估具有遗传或表型上这些免疫细胞亚群水平升高的个体是否表现出更高的DR发病率或更快进展。此外，应用流式细胞术或单细胞测序对外周血或眼组织进行免疫谱分析，可评估遗传预测的免疫细胞模式与其在糖尿病患者中实际表达的一致性。

局限性

本研究主要揭示欧洲 ancestry 个体中不同免疫细胞表型与DR遗传易感性的关系，不能外推至非洲或亚洲人群。MR反映的是免疫细胞表型的遗传倾向而非体内实际免疫细胞计数或活性水平，限制了其捕捉DR动态免疫反应的能力。DR相关GWAS缺乏亚型特异性数据，阻碍了免疫细胞表型对活动性与静止性增殖性DR差异效应分析。尽管鉴定出11种免疫细胞表型与DR遗传相关，但其潜在生物学机制尚不清楚。CD8br NKT AC和HLA DR on CD33br HLA DR+ CD14?的MR结果存在异质性可能引入潜在偏倚。尽管MR-Egger回归未检测到水平多效性，但未检测到或残留多效性的可能性不能完全排除。

结论

MR分析揭示CD80 on plasmacytoid DC、CD80 on CD62L+ plasmacytoid DC、CD80 on myeloid DC、CD8br NKT AC、CD3 on NKT、CD4 on resting Treg、CD4/CD8br、HLA DR on CD33br HLA DR+ CD14?、CD28+ CD45RA? CD8dim AC、CD28? CD25++ CD8br %T cell和CD33? HLA DR? AC与DR遗传易感性增加相关。这些发现为DR发病机制和药物开发提供了新视角。但由于临床证据有限，需要进一步生物学研究阐明具体机制。