骨髓源性巨噬细胞代谢记忆通过CEBPB介导的炎症持续损害糖尿病骨折愈合的机制研究

《Stem Cell Research & Therapy》：BMDMs in metabolic memory impair fracture healing in diabetes

本研究针对糖尿病患者血糖控制后骨折不愈合风险仍高的问题，揭示了骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）在高血糖诱导的代谢记忆状态下通过CEBPB-JAK1/STAT6通路维持促炎表型（M1极化），持续分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子，抑制BMSCs成骨分化和HUVECs血管生成，最终导致骨折愈合障碍。该发现为糖尿病骨折并发症的治疗提供了新靶点。

　　

糖尿病是全球性的健康挑战，影响着超过5.37亿人，其并发症严重威胁着患者的生命质量和预期寿命。尽管降糖治疗不断进步，但糖尿病患者骨折后延迟愈合和不愈合的风险依然居高不下，这提示高血糖可能在某些细胞中留下了持久的“记忆”，即使血糖恢复正常，其负面影响仍持续存在。这种现象被称为“代谢记忆”，在糖尿病并发症如动脉粥样硬化、肾病和心血管疾病中已有报道，但在骨折愈合领域却鲜有研究。骨折愈合是一个复杂的生理过程，涉及炎症、骨形成和血管生成等多个环节，而巨噬细胞，特别是骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），作为免疫调节和组织修复的关键角色，其功能状态对愈合过程至关重要。先前研究表明，高血糖可导致BMDMs处于病理性炎症状态，分泌大量促炎因子，干扰成骨和血管生成，但BMDMs是否具有代谢记忆特性，以及其如何持续影响糖尿病骨折愈合，尚不明确。

为了深入探索这一问题，Zhang等人在《Stem Cell Research & Therapy》上发表的研究，通过整合动物模型、细胞实验和多组学分析，系统揭示了BMDMs代谢记忆在糖尿病骨折愈合中的核心作用及分子机制。研究人员首先建立了糖尿病小鼠骨折模型，分为对照组（Ctrl）、糖尿病组（DM）和血糖控制组（DM/GC），通过Micro-CT和组织学分析发现，即使血糖恢复正常（DM/GC组），如果先前高血糖暴露超过8周，骨折愈合仍显著受损，表现为骨痂体积减小、骨体积分数（BV/TV）下降和炎症标志物增加。体外实验中，BMDMs在经历短暂高糖（HG, 30 mM）刺激后即使回归正常糖（NG, 5.5 mM）条件，仍持续高表达IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子，M1型巨噬细胞比例升高，并抑制BMSCs的成骨分化（ALP和ARS染色减弱，Runx2和OCN表达下调）和HUVECs的血管生成（迁移和管形成能力下降，VEGF和CD31表达降低）。通过RNA-seq和ATAC-seq联合分析，发现炎症通路激活和转录因子CEBPB上调是代谢记忆的关键；机制上，CEBPB抑制JAK1/STAT6通路，阻碍M2型抗炎极化。最后，利用外泌体递送si-CEBPB可逆转BMDMs的促炎表型，并显著改善糖尿病小鼠的骨折愈合。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 糖尿病小鼠骨折模型构建及血糖控制干预（ streptozotocin诱导糖尿病，胰岛素治疗）；2. 细胞培养与极化分析（BMDMs体外高糖/正常糖转换模型，流式细胞术检测M1/M2标志物CD86/CD206）；3. 功能实验（BMSCs成骨诱导与HUVECs血管生成 assays，包括ALP/ARS染色、划痕和管形成实验）；4. 多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq联合鉴定差异基因和染色质可及性）；5. 分子干预（siRNA沉默CEBPB，外泌体递送技术）；6. 组织学与影像评估（Micro-CT、H&E、Masson、免疫荧光染色）。患者骨样本来源为武汉大学中南医院骨折手术患者（非糖尿病、血糖控制差/佳糖尿病患者）。

BMDMs are involved in the sustained effects of hyperglycemia on fracture even after glucose normalization in diabetic rats

通过动物实验发现，糖尿病（DM）和血糖控制后（DM/GC）组在高血糖暴露超过8周后，即使血糖恢复正常，骨折愈合仍受损，表现为骨折间隙增大、骨痂体积减小，且骨折部位M1型巨噬细胞（F4/80⁺CD86⁺）增多，促炎细胞因子（iNOS、TNF-α）表达升高。这表明BMDMs在高血糖消退后仍持续促炎状态，介导代谢记忆效应。

Evidence of hyperglycaemia-induced metabolic memory in BMDMs

体外实验显示，BMDMs在经历10天以上高糖刺激后即使回归正常糖条件，仍保持高 glycolytic activity（ECAR升高）、促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）分泌增加和M1型极化（CD86⁺和iNOS⁺细胞增多），证实高血糖可诱导BMDMs形成代谢记忆。

BMDMs in hyperglycaemia-induced metabolic memory attenuate the process of osteogenesis and angiogenesis

代谢记忆状态的BMDMs条件培养基显著抑制BMSCs的成骨分化（ALP活性、矿化结节及Runx2、OCN表达下调）和HUVECs的血管生成（迁移、管形成及VEGF、CD31表达减弱），表明其通过旁分泌作用破坏骨修复微环境。

Transcriptional analysis shows that inflammatory factors are associated with the hyperglycaemia-induced metabolic memory in BMDMs

RNA-seq分析显示，代谢记忆组BMDMs中2114个基因上调（包括IL-6、IL-1β、TNF、HIF-1α等炎症因子），1505个基因下调；GSEA提示NF-κB、NOD-like receptor、TNF和AGE-RAGE等炎症通路激活，表明转录重编程是代谢记忆的分子基础。

Integrative analysis of RNA-seq and ATAC-seq in BMDMs with hyperglycemia-induced metabolic memory

联合分析发现342个基因的表达与染色质可及性变化正相关（R=0.8），Motif富集和蛋白验证确定CEBPB为关键转录因子，其在代谢记忆组BMDMs及糖尿病患者骨样本中均高表达。

siRNA-mediated knockdown of CEBPB partially reverses hyperglycaemia-induced metabolic memory in BMDMs and its adverse effect on osteogenesis and angiogenesis

沉默CEBPB可降低BMDMs的TNF-α表达、增加Arg-1表达，促进BMSCs成骨分化和HUVECs血管生成，证明CEBPB是逆转代谢记忆的核心靶点。

CEBPB is associated with JAK1/STAT6 pathway when BMDMs in hyperglycaemia-induced metabolic memory and delivering si-CEBPB to fracture sites using exosomes can enhance diabetic fracture healing

机制上，CEBPB抑制JAK1/STAT6磷酸化，阻碍M2极化；外泌体递送si-CEBPB可激活JAK1/STAT6通路，减少骨折部位M1巨噬细胞，改善糖尿病小鼠骨折愈合（Micro-CT显示骨痂体积和BV/TV增加）。

该研究首次证实BMDMs在高血糖诱导下形成代谢记忆，通过CEBPB-JAK1/STAT6轴维持促炎表型，持续破坏成骨和血管生成，导致糖尿病骨折愈合障碍。这不仅解释了为何血糖控制后骨折风险仍高，也为靶向CEBPB（如外泌体递送siRNA）治疗糖尿病骨并发症提供了新策略。研究整合多组学、分子干预和临床样本，为代谢记忆机制提供了深入见解，具有重要的临床转化潜力。