基于中性粒细胞胞外诱捕网的类风湿关节炎生物标志物计算分析及靶向药物发现

《European Journal of Medical Research》：Identification of biomarkers related to neutrophil extracellular traps and potential therapeutic drugs for rheumatoid arthritis using computational analysis

本研究针对类风湿关节炎(RA)发病机制中中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)作用机制不清的问题，通过计算生物学方法筛选NETs相关生物标志物及潜在治疗药物。研究人员整合GEO数据库转录组数据，结合GSVA、WGCNA和机器学习算法，鉴定出ANGPTL1、CASP8、FNIP2、MEOX2和ZNF780B五个关键基因，并通过分子对接预测N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和Eckol具有良好结合活性，为RA精准诊疗提供新靶点。

　　

在慢性自身免疫性疾病领域，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)始终是困扰全球数千万患者的健康难题。这种以关节滑膜持续性炎症为特征的疾病，不仅导致关节结构进行性破坏，更可能引发关节畸形和功能丧失，给患者生活质量带来严重影响。尽管研究表明遗传易感性和环境因素如粉尘、烟雾等与RA发病相关，但其确切发病机制至今尚未完全阐明。近年来，随着免疫学研究的深入，中性粒细胞这种人体内最丰富的白细胞亚群，被发现在RA病理过程中扮演着关键角色。

传统观点认为，中性粒细胞主要通过吞噬作用和脱颗粒发挥免疫防御功能，但近年发现的中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)机制，为理解RA发病机制提供了全新视角。当受到炎症因子刺激时，中性粒细胞会释放其染色质物质和丰富的颗粒酶，交织形成复杂的网状结构——NETs。这些由高度修饰和浓缩的染色质、DNA、组蛋白和中性粒细胞特异性蛋白组成的防御结构，在RA患者体内水平显著升高，提示其积极参与疾病发生发展。特别值得注意的是，NETs中释放的瓜氨酸化组蛋白可被抗瓜氨酸肽抗体(ACPA)识别，从而作为自身抗原触发免疫反应。然而，NETs相关基因在RA中的具体作用机制、关键生物标志物及其潜在治疗价值，仍有待系统探索。

针对这一科学问题，Sheng等研究人员在《European Journal of Medical Research》上发表了创新性研究成果。研究团队通过整合多组学数据与计算生物学方法，系统揭示了NETs相关基因在RA中的分子机制，并筛选出具有潜在治疗价值的候选药物。

研究方法上，团队首先从GEO数据库获取GSE45291和GSE17755两个数据集，包含625例RA患者和65例对照样本。通过基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis, GSVA)计算NETs评分，利用ConsensusClusterPlus进行样本分型，应用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)构建基因模块，结合LASSO回归和支持向量机递归特征消除(support vector machine recursive feature elimination, SVM-RFE)机器学习算法筛选关键基因，并通过受试者工作特征曲线下面积(area under the curve, AUC)评估诊断效能。实验验证采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测基因表达，最后通过DSigDB数据库预测靶向药物并进行分子对接验证。

NETs相关聚类分析揭示RA异质性

研究结果显示，RA患者NETs评分显著高于对照组，提示NETs相关基因积极参与RA发病机制。通过一致性聚类分析，RA样本被分为两个分子亚型（C1和C2）。免疫浸润分析发现C2簇中T细胞、NK细胞和成纤维细胞浸润水平更高，而C1簇则呈现更显著的中性粒细胞浸润特征，这表明RA患者存在基于NETs的异质性分子分型。

WGCNA识别关键基因模块

研究人员通过WGCNA构建基因共表达网络，发现棕色模块与C1/C2聚类密切相关，该模块基因显著富集于中性粒细胞激活、脱颗粒等生物学过程。同时，黄色模块与RA表型高度相关，主要参与脂质代谢过程调控、肽基-酪氨酸磷酸化和修饰等通路。这些发现将中性粒细胞功能与代谢重编程联系起来，为理解RA发病机制提供了新视角。

多步骤筛选鉴定核心生物标志物

通过差异表达分析筛选出377个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，与WGCNA模块基因取交集后获得8个关键基因。进一步利用LASSO和SVM-RFE两种机器学习算法交叉验证，最终确定ANGPTL1、CASP8、FNIP2、MEOX2和ZNF780B五个基因作为RA诊断生物标志物。这些基因在训练集和验证集中均表现出优异的诊断性能(AUC>0.7)。

实验验证与免疫机制解析

qRT-PCR实验证实了五个生物标志物在RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)中的表达变化：ANGPTL1、CASP8、FNIP2和ZNF780B表达上调，MEOX2表达下调。免疫浸润分析显示RA患者中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等先天免疫细胞浸润水平显著升高。相关性分析发现这些生物标志物与中性粒细胞浸润呈正相关，特别是与Th2细胞和嗜酸性粒细胞浸润密切相关。

靶向药物预测与分子对接验证

通过DSigDB数据库筛选出N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)和Eckol作为CASP8的潜在靶向药物。分子对接结果显示，这两种化合物与CASP8蛋白的结合能分别为-5.17 kcal/mol和-5.08 kcal/mol，均低于-5.0 kcal/mol的阈值，表明它们与CASP8具有较高的结合亲和力。氢键分析显示药物分子能够通过稳定的氢键网络与CASP8活性位点形成特异性相互作用。

这项研究的结论部分强调了NETs相关基因在RA发病机制中的核心地位。五个关键生物标志物中，ANGPTL1和CASP8可能通过调节白细胞介素-6(IL-6)/Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路和干扰素-γ反应影响RA炎症进程；而FNIP2、MEOX2和ZNF780B则与糖酵解等代谢通路密切相关，可能通过改变RA滑膜细胞的能量代谢状态参与疾病发展。

研究的创新性在于首次系统整合NETs相关基因分析、机器学习算法和分子对接技术，为RA精准医疗提供了新的生物标志物体系和治疗靶点。特别是预测的NAC和Eckol两种化合物，前者作为抗氧化剂前体已知具有抗炎特性，后者作为褐藻多酚类化合物展现多重生物活性，均为RA治疗药物开发提供了新方向。

然而，研究也存在一定局限性，如仅基于转录组数据未能验证蛋白水平表达，样本来源相对有限，缺乏药物干预和纵向随访数据等。未来研究需要结合多组学数据、更大规模临床队列和功能实验，进一步验证这些生物标志物的临床转化价值。总体而言，该研究为理解RA发病机制提供了新视角，为开发基于NETs的RA精准诊疗策略奠定了重要基础。