系统误分类森林型登革病毒2型（DENV-2）感染为“未定血清型”：对常规RT-qPCR监测的影响及对策

《Tropical Medicine and Health》：Systematic misclassification of sylvatic dengue virus 2 (DENV-2) infections as “undetermined serotype”: implications in routine RT-qPCR surveillance

本刊推荐：针对商业登革热分子血清分型试剂盒无法准确识别森林型DENV-2，导致其被误判为“未定血清型”的问题，研究人员系统分析了塞内加尔和马来西亚的监测数据，结合全基因组测序验证，揭示了当前分子检测工具的局限性，并提出更新引物探针设计、加强测序验证等解决方案，对提升全球登革热监测和疫苗评估框架具有重要意义。

　　

在全球热带与亚热带地区，登革热是由登革病毒（Dengue Virus, DENV）引起的最重要的虫媒传染病之一，其病原体包括四种血清型（DENV-1至DENV-4），每一型均可导致从轻微发热到危及生命的重症登革。常规的病毒监测和分型依赖于逆转录实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，使用针对保守基因组区域（如C-prM/E/NS5）设计的引物和探针，以实现快速、高特异性的血清型鉴定。然而，越来越多的证据表明，在人类病例中，除了广泛流行的人源（城市型）病毒株外，还存在一类主要在非人灵长类和森林蚊媒中循环的森林型（sylvatic）病毒谱系，它们因长期在不同宿主中进化，积累了较多的基因变异，可能导致基于PCR的分子检测出现盲区。

近期，来自塞内加尔和马来西亚的研究相继发现，多个商业化的DENV血清分型试剂盒无法对部分阳性样本完成分型，这些样本最初被报告为“未定血清型”（Undetermined Serotype）或检测失败，但经全基因组测序证实，它们实际上属于森林型DENV-2感染。这一系统性误分类不仅造成监测数据的不准确，还可能掩盖森林型病毒向人群传播的早期信号，影响对疫情态势的感知与应对的及时性，甚至对疫苗有效性和中和抗体广度评估产生潜在偏倚。

在这一背景下，Idrissa Dieng在《Tropical Medicine and Health》发表了题为“Systematic misclassification of sylvatic dengue virus 2 (DENV-2) infections as ‘undetermined serotype’: implications in routine RT-qPCR surveillance”的通讯文章，通过综合分析来自西非塞内加尔（Kédougou和Kolda地区）及东南亚马来西亚的监测证据，指出当前全球登革监测体系中存在的这一共性技术局限，并呼吁尽快更新检测策略与方法，以提升对森林型登革病毒的识别能力。

为开展本项分析，作者并未进行新的湿实验，而是基于已发表的监测数据与基因组序列开展二次分析。关键技术方法包括：使用广泛采用的商业化RT-qPCR血清分型试剂盒（如CDC Dengue Typing Kit）对患者样本进行筛查；对血清型未定的样本进行全基因组测序（包括鸟枪法测序和扩增子贴砖测序）以确认病毒谱系；通过生物信息学方法（如ThermoBLAST、MFEprimer等）对引物和探针结合区域进行错配分析和热力学建模，评估其与森林型参考基因组的覆盖度。

研究结果

系统性的血清型误分类现象

Suppiah等近期在马来西亚的登革监测中多次发现“未定血清型”结果，测序证实多数属于森林型DENV-2，一例为高度 divergent 的DENV-3谱系。这与塞内加尔自2020–2021年以来在Kédougou和Kolda地区的发现高度一致。这些结果提示，森林型病毒感染被现有分子工具系统性漏检，并被归因于引物—探针结合区域的多位点错配。

分子机制：引物—探针结合效率下降

现有血清分型 assays 主要针对城市型DENV1–4优化，而森林型病毒在非人灵长类和森林蚊媒中循环时，在引物/探针结合位点累积的碱基替换导致解链温度（Tm）和结合能下降，扩增效率与探针杂交效率降低。尽管样本在泛登革病毒检测（pan-DENV assay）中呈阳性且病毒RNA充足，仍无法成功分型。

对公共卫生监测的潜在影响

森林型登革病毒在人群中的真实流行程度被低估，尤其在森林型与城市型传播循环共存的地区；“未定血清型”结果可能延误对森林型病毒早期传播的识别，影响疫情响应速度；若森林型谱系隐匿传播，其抗原和遗传多样性未被认知，可能影响疫苗有效性评价和中和抗体广度评估。

建议与推荐

作者建议，监测实验室应把“未定血清型”结果视为测序（扩增子贴砖或宏基因组测序）的触发条件，并暂报为“DENV阳性-血清型待定（测序确认中）”；试剂开发者应定期使用包含森林型参考基因组（如西非DENV-2及其它divergent进化枝）的校正panel进行引物—探针覆盖度审核，并采用热力学错配分析、in-silico PCR、覆盖热图等工具；更新血清分型 assays，在已知错配位点引入简并碱基或锁核酸（LNA），并考虑增加冗余靶区域（如E和NS5）以降低单一位点失效风险；使用定量RNA标准品测定代表性森林型分离株的检测限（LoD）和ΔCt延迟，并在试剂盒交叉反应和包容性性能中明确包含森林型基因组；在监测数据看板中，应将“未定”与“阴性”分开，并增设“推定森林型谱系”类别以待测序确认；加强基因组数据流与快速谱系分型反馈，优先存档所有“未定”病例。

结论与讨论

塞内加尔与马来西亚的汇聚性证据表明，当前RT-qPCR血清分型 assays 存在系统性的诊断盲区：这些方法仅针对城市型DENV优化，却反复漏检森林型谱系。作者呼吁尽快对检测方法进行重新校正，并对“未定”结果实施反射性测序，同时加强对城市型和森林型病毒多样性的引物—探针监测。这些举措将有助于提高病例确认的准确性，加速暴发早期识别，并加强疫苗和治疗药物评价的框架。

本通讯虽未报告原始数据，但通过整合多国证据和提出清晰的技术建议，为全球登革监测和病毒分型技术的更新提供了重要依据。值得注意的是，森林型病毒是否具备更强的致病性或传播力仍属未知，但其持续溢出到人群的风险值得警惕。未来，开发能同时覆盖城市和森林谱系的多重检测方法，将成为提升全球登革病毒监测能力的关键方向。