内含子变异导致CLCN5基因RNA剪接异常在Dent疾病中的作用机制研究

《BMC Medical Genomics》：Three intronic variants altering RNA splicing were identified in the CLCN5 gene by minigene assay

本研究针对Dent疾病1型致病基因CLCN5的内含子变异如何影响pre-mRNA剪接这一科学问题，通过生物信息学筛选和minigene（微型基因）剪接实验，首次系统鉴定了三个致病性内含子变异（c.603+4A>G、c.727-3C>A和c.933+3A>C），发现它们通过破坏经典剪接位点或激活隐匿剪接位点导致外显子跳跃或部分缺失，为缺乏RNA样本的遗传病诊断提供了有效的功能验证方法。

　　

在遗传性肾脏疾病研究领域，Dent疾病1型作为一种罕见的X连锁隐性遗传肾小管疾病，长期以来困扰着临床医生和研究人员。这种疾病主要表现为低分子量蛋白尿（LMWP）、高钙尿症、肾结石和进行性肾功能损害，其致病基因CLCN5编码的氯离子通道蛋白ClC-5在肾小管功能中发挥着至关重要的作用。

然而，当前对CLCN5基因变异的研究主要集中于外显子区域和经典剪接位点，而对内含子区域变异如何影响pre-mRNA（前体信使RNA）剪接的认识仍存在显著空白。随着基因组学研究的深入，越来越多的证据表明，内含子区域的单核苷酸变异可能通过改变各种剪接调控信号，影响pre-mRNA的正常剪接过程，从而导致疾病的发生。这一机制在多种遗传性疾病中已被证实，但在Dent疾病1型的研究中尚未得到系统探索。

在这一背景下，乔丹等人发表在《BMC Medical Genomics》的研究针对这一科学问题展开了深入探索。研究人员意识到，准确评估内含子变异对剪接的影响对于理解疾病发病机制和进行准确的遗传咨询至关重要，特别是在缺乏患者RNA样本的情况下，需要建立可靠的功能验证方法。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先从ClinVar数据库收集CLCN5基因变异信息，利用BDGP生物信息学软件预测变异对剪接位点的影响；随后构建包含目标外显子及侧翼内含子序列的pSPL3微型基因载体，通过定点突变技术引入候选变异；最后在HEK293T和Hela细胞系中进行剪接实验，通过RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）和Sanger测序（桑格测序）分析剪接产物。

变异筛选与实验设计

研究人员从ClinVar数据库中收集了CLCN5基因的变异信息，通过生物信息学分析筛选出四个候选内含子变异：c.416-6A>T、c.603+4A>G、c.727-3C>A和c.933+3A>C。这些变异均位于外显子-内含子交界区域附近，且生物信息学预测显示它们可能影响5'供体剪接位点（5'ss）或3'受体剪接位点（3'ss）的功能。研究人员排除了位于第一个和最后一个外显子/内含子的变异，因为这些区域无法通过minigene assay进行有效分析。

剪接异常变异的鉴定

研究发现，四个候选变异中有三个（c.603+4A>G、c.727-3C>A和c.933+3A>C）确实引起了pre-mRNA剪接异常。变异c.603+4A>G位于第5外显子下游的内含子区域，该变异削弱了经典供体剪接位点的强度，导致同时激活两个隐匿的5'ss，产生两种异常转录本：一种缺失第5外显子最后131bp的部分缺失转录本（占44.65%/42.30%），另一种完全跳过第5外显子（占55.35%/57.70%）。这两种异常剪接均导致移码突变和蛋白质截短（p.Ile159Ser fs40和p.Ala142Cys fs38）。

变异c.727-3C>A位于第7外显子上游3bp处，严重损害了受体剪接位点的识别。该变异产生了两种异常转录本：一种缺失第7外显子首端32bp（占71.49%/61.90%），另一种缺失首端88bp（占28.51%/38.10%），通过激活不同的受体剪接位点导致移码突变（p.Ile243Gly fs5和p.Ile243Cys fs5）。

变异c.933+3A>C位于第7外显子末端内含子区域，显著降低了供体剪接位点的评分，导致第7外显子完全跳过，产生框内缺失（codon 243-311）。相比之下，变异c.416-6A>T虽然轻微降低了受体剪接位点评分，但minigene实验显示其并未引起剪接异常。

蛋白质结构预测分析

研究人员利用AlphaFold 3对突变蛋白结构进行预测，发现部分或完全跳过第5或第7外显子会导致蛋白质截短，影响CLC-5蛋白的多个重要结构域，包括CBS结构域和其他关键区域。这些结构改变将阻止CLC-5在肾脏中执行其正常的生理功能。

研究意义与局限性

该研究首次系统评估了CLCN5基因内含子变异对pre-mRNA剪接的影响，证实了minigene assay在评估剪接变异中的实用价值。研究结果强调了在RNA水平评估DNA变异影响的重要性，特别是在缺乏患者RNA样本的情况下，minigene分析为变异致病性的判定提供了可靠依据。

然而，研究人员也指出了研究的局限性：minigene assay可能无法完全模拟体内复杂的调控机制；实验结果可能因细胞类型特异性而有所不同；缺乏患者RNA样本的直接验证。这些因素需要在未来的研究中加以考虑。

临床意义与治疗前景

该研究不仅为Dent疾病1型的分子诊断提供了重要依据，也为遗传咨询和家族遗传风险评估提供了有价值的信息。随着反义寡核苷酸（ASO）疗法在纠正异常剪接方面的不断发展，针对这些剪接变异的特异性治疗策略有望成为未来研究的方向。通过阻断异常剪接位点的识别序列，ASO疗法可能恢复正常的剪接模式，为Dent疾病1型的治疗提供新的希望。

综上所述，这项研究深入揭示了CLCN5基因内含子变异通过影响pre-mRNA剪接导致Dent疾病1型的分子机制，建立了有效的功能验证平台，为罕见遗传性肾脏疾病的精准诊断和治疗策略开发奠定了重要基础。