铁死亡相关基因HSPA5调控肺腺癌免疫逃避及预后的机制与临床意义研究

《Hormones & Cancer》：The influence of ferroptosis-associated gene HSPA5 on the prognosis and immune evasion of lung adenocarcinoma

本研究针对肺腺癌(LUAD)免疫治疗耐药难题，通过生物信息学筛选发现铁死亡相关基因HSPA5在肿瘤组织中高表达。实验证实HSPA5通过转录因子(CTCF/KDM5B/STAT3)和ceRNA网络调控促进免疫逃避，敲低HSPA5可诱导LUAD细胞凋亡并增加ROS/Fe2+水平。该基因可作为LUAD免疫疗效预测标志物，为个性化治疗提供新靶点。

　　

在全球范围内，肺癌始终是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管分子靶向治疗和免疫治疗的出现显著推进了肺腺癌(LUAD)的治疗进展，但五年生存率仍然不容乐观。肿瘤细胞通过表达免疫调节因子来调控肿瘤免疫微环境(TIME)，从而促进免疫逃避，这成为癌症进展中的重要里程碑。因此，针对TIME的治疗策略，旨在打破肿瘤诱导的免疫逃避，已成为当前研究的焦点。

铁死亡(Ferroptosis)作为一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，其本质在于细胞内铁水平升高导致的膜脂过氧化物积累。大量研究表明，铁死亡与多种癌症的进展相关，包括胰腺癌、膀胱癌、胃癌和肺癌。同时，越来越多的证据强调铁死亡调节因子如SLC7A11和GPX4在LUAD的发生和发展中起着关键作用。值得注意的是，调控铁死亡有可能通过增强化疗和分子靶向治疗的效果来抑制肿瘤进展。然而，铁死亡在LUAD中的确切作用和潜在机制仍有待完全阐明。

熊磊等研究人员在《Discover Oncology》上发表的研究，旨在通过生物信息学技术筛选与肺腺癌铁死亡相关的差异表达基因，试图找出那些显著影响该恶性肿瘤预后和免疫逃避的铁死亡相关基因。他们综合利用TCGA和GEO数据库的RNA-seq数据及LUAD临床信息，通过差异表达分析鉴定铁死亡相关差异表达基因(DEGs)，并探讨这些基因与预后的关系。同时，利用TIDE内置数据集分析铁死亡基因与免疫逃避的相关性，筛选出核心基因。进而利用TCGA测序数据深入探究铁死亡基因的调控机制。最后，通过细胞实验探讨敲低有潜力的铁死亡基因HSPA5后LUAD细胞生物学功能的改变。

研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：从TCGA和GEO数据库获取LUAD的RNA-seq数据和临床信息进行生物信息学分析；使用TIDE算法评估样本免疫逃避潜能；通过Venn图分析筛选核心基因；利用ENCODE和StarBase等数据库构建转录因子和ceRNA调控网络；采用DNA甲基化和RNA甲基化测序数据分析表观遗传调控；通过细胞培养、siRNA转染、Western blotting、MTT、集落形成、EdU、Transwell、流式细胞术、ROS和铁离子检测等技术进行体外功能验证。

3.1 铁死亡相关基因的筛选

通过深入文献回顾，研究人员确定了22个与铁死亡相关的基因，这些基因基于其在铁死亡、细胞代谢、氧化应激和DNA损伤修复等生物过程中的关键作用，以及它们在多种疾病特别是癌症中潜在的调控机制而被选中。

3.2 肺腺癌中铁死亡相关差异表达基因的鉴定

利用GSE27262和TCGA-LUAD的转录组数据，研究人员鉴定了肺腺癌与正常组织相比的铁死亡相关DEGs。筛选标准为|logFC|>0.75且p<0.05。在GSE27262数据库中发现6个DEGs，而在TCGA数据库中获得11个DEGs。通过取交集，得到四个共同基因：ACSL4、DPP4、HSPA5和HSPB1。值得注意的是，ACSL4在肿瘤组织中表达较低，而DPP4、HSPA5和HSPB1在肿瘤组织中表达较高。

3.3 肺腺癌中铁死亡相关基因的预后分析

为了阐明铁死亡相关基因与肺腺癌预后的联系，研究人员分析了TCGA、GSE31210和GSE26939数据集的临床数据。共有九个基因(HSPA5、GLS2、CDKN1A、FANCD2、SLC7A11、SLC1A5、CARS1、ALOX15、RPL8)在三个数据库中一致地与肺腺癌预后相关。具体而言，在TCGA和GSE31210数据库中，HSPA5高表达的患者比低表达患者预后更差，表明HSPA5高表达是肺腺癌的一个风险因素。

3.4 探索铁死亡基因与肺腺癌免疫逃避的关联

利用TIDE内置数据集分析，研究人员考察了铁死亡基因在不同免疫治疗数据集中的表达模式，以揭示那些在免疫逃避中起关键作用的基因。例如，ALOX15在TAM M2巨噬细胞中表达上调，HSPA5在ICB_Braun2020_PD1数据集中表达上调，HSPB1在CAF FAP细胞中表达上调。相关性分析显示，ALOX15与免疫功能障碍呈正相关，而SLC7A11、SLC1A5、RPL8、HSPA5、FANCD2、EMC2和CS与免疫功能障碍呈负相关。总之，HSPA5表达降低有助于增强对PD-1免疫治疗的反应性，促进T细胞功能，从而潜在地提高治疗效果。

3.5 核心基因调控机制的预测

通过维恩图分析筛选出与预后和免疫逃避均相关的核心铁死亡基因后，研究人员进一步探索了它们的调控机制。为了深入了解HSPA5的转录调控，他们预测了可能与其启动子区域结合的转录因子(TFs)。利用ENCODE数据库的转录因子ChIP-seq数据，发现CTCF、KDM5B和STAT3与HSPA5表达水平呈显著正相关，并预测了这些TF在HSPA5上的结合位点。此外，研究人员利用StarBase数据库构建了由HSPA5、SLC7A11、SLC1A5、FANCD2和ALOX15调控的ceRNA网络。例如，HSPA5通过ceRNA网络作为hsa-miR-5009-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-588和hsa-miR-3529-5p的分子海绵，调控SNHG16、OIP5-AS1和HCG18等lncRNA的表达。

3.6 核心基因DNA甲基化和RNA甲基化调控的预测

利用TCGA-LUAD的DNA甲基化测序和RNA-seq数据，研究人员全面分析了基因甲基化位点与铁死亡候选基因表达的相关性。为了预测RNA甲基化是否参与调控这些基因，他们利用了RM2Target和RMBase数据库。预测结果显示，HSPA5受到多种RNA甲基化修饰的调控，包括2'-O-甲基化、A-to-I编辑、m5C、m6Am、m6A和m7G修饰。研究人员构建了一个包含DNA甲基化和RNA甲基化机制的综合调控网络，显示ALOX15、FANCD2、HSPA5、RPL8、SLC1A5和SLC7A11均受DNA甲基化调控，而其他基因则通过多种方式包括RNA甲基化进行调控。

3.7 HSPA5对LUAD细胞生物学功能的调控作用

为了验证HSPA5对LUAD患者预后的影响，研究人员在LUAD细胞系中靶向敲低了HSPA5。Western blotting分析证实了HSPA5的成功敲低及其表达减少。随后，MTT实验显示敲低HSPA5后A549和PC-9细胞的活力显著降低。平板集落形成实验进一步证实了抑制HSPA5后两种细胞集落形成能力的下降。EdU掺入实验表明敲低HSPA5后A549和PC-9细胞的增殖率大幅下降。此外，Transwell迁移实验显示下调HSPA5后A549和PC-9细胞的迁移能力显著降低。重要的是，流式细胞术分析表明敲低HSPA5后A549细胞的凋亡率显著增加。为了进一步确定HSPA5在铁死亡中的作用，研究人员在敲低HSPA5后，或敲低后用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理细胞，然后检测细胞活性氧(ROS)和铁离子水平。他们发现敲低HSPA5能够增加ROS和铁离子水平，而同时用Ferrostatin-1处理则可以逆转由HSPA5敲低介导的促进作用。

本研究通过综合生物信息学分析和实验验证，深入探讨了铁死亡相关基因与肺腺癌预后和免疫逃避的关联。研究结果表明，铁死亡相关基因HSPA5可能通过促进免疫逃避来降低LUAD免疫治疗的疗效，从而成为预测LUAD患者免疫治疗反应的潜在标志物。值得注意的是，HSPA5低表达的患者往往预后更好。

HSPA5，通常称为GRP78或BIP，主要位于内质网(ER)，作为ER内HSP70家族的分子伴侣，协助蛋白质折叠和组装，在维持ER稳态中起着至关重要的作用。近年来，许多研究揭示了铁死亡与肿瘤微环境(TME)之间复杂的相互作用。本研究发现了HSPA5与LUAD免疫治疗期间的免疫功能障碍存在显著关联，表明HSPA5可能在LUAD的TIME调控中扮演关键角色。

该研究首次揭示了铁死亡、LUAD预后和免疫逃避之间的复杂关系，为理解LUAD的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要线索。HSPA5的表达水平有望成为评估LUAD免疫治疗疗效的有力工具。未来的研究需要直接实验证据来验证这些发现，并进一步阐明HSPA5的具体调控机制。此外，相关的临床前瞻性数据和单细胞测序结果对于在临床环境中阐明HSPA5的作用至关重要。

总之，铁死亡相关基因HSPA5是影响LUAD预后和免疫治疗反应的关键因子。对其功能的深入研究不仅有助于揭示铁死亡与肿瘤免疫微环境之间的相互作用机制，而且为LUAD的个性化治疗和免疫治疗策略的优化提供了新的思路和潜在的靶点。