基于AuNPs-Co3O4-CuO@MWCNTs纳米复合材料的无标记免疫传感平台用于微生物毒素的高灵敏检测

《Advanced Composites and Hybrid Materials》：Nanostructured Co3O4-CuO@MWCNTs functionalized platform for label-free immunosensing of microbial toxins

本研究针对金黄色葡萄球菌α-溶血素（Hla）的快速检测需求，构建了基于AuNPs-Co3O4-CuO@MWCNTs纳米复合材料的无标记电化学免疫传感器。通过优化纳米复合比例、抗体负载浓度及识别时间，实现了对Hla的高灵敏度检测（LOD=0.01 ng/mL），在食品样品中回收率达96.0–107%，为食品安全监测提供了新型便携式检测方案。

　　

微生物感染引发的疾病高死亡率与食源性病原体密切相关，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生的α-溶血素（α-hemolysin, Hla）是关键毒力因子。这种毒素通过形成跨膜孔道直接破坏宿主细胞膜，导致单核细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞等多种哺乳动物细胞裂解，引发严重健康问题。现有Hla检测方法存在局限性：分子印迹聚合物结合表面等离子体共振（SPR）技术操作复杂，红细胞伪装传感器需间接检测，活细胞电化学系统则稳定性不足。因此，开发高灵敏、快速且适用于复杂基质的检测技术成为迫切需求。

本研究发表于《Advanced Composites and Hybrid Materials》，通过构建新型纳米结构免疫传感平台，实现了对Hla的直接、无标记、高灵敏检测。研究人员采用钴铜双金属氧化物（Co₃O₄-CuO）与多壁碳纳米管（MWCNTs）、金纳米颗粒（AuNPs）复合，形成AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs纳米复合材料，修饰于丝网印刷电极（SPE）表面，并通过硫辛酸（LPA）自组装层共价固定抗Hla抗体，最终形成便携式电化学免疫传感器。

关键技术方法包括：1）水热合成Co₃O₄-CuO双金属氧化物及化学还原法制备AuNPs；2）纳米材料结构表征（XRD、Raman、FTIR、TEM、SEM-EDX）；3）电化学性能优化（循环伏安法CV与电化学阻抗谱EIS）；4）免疫传感器构建与抗体固定化；5）实际食品样本（牛肉、酸奶、奶酪、牛奶）中Hla加标回收实验。

3.1 纳米材料结构与形貌表征

通过FTIR、XRD、TEM和Raman光谱证实了纳米材料的成功合成与复合：Co₃O₄呈球形（48±5 nm），CuO为立方状（22±4 nm），AuNPs粒径为13±3 nm，MWCNTs直径约9.5 nm。XRD显示Co₃O₄为立方相，CuO为单斜相，复合后保持晶体结构完整性。Raman光谱中MWCNTs的D/G峰强度比（I_D/I_G=1.08→1.13）表明纳米管与金属氧化物间存在电荷转移与表面功能化。

3.2 传感器电化学性能优化

CV和EIS测试表明，Co₃O₄:CuO比例为80:20时电子传输效率最高（R_ct最低）。加入MWCNTs后，电化学活性面积从0.07 cm²增至0.15 cm²。AuNPs浓度为3 μL（58 ppm）时抗体固定化效果最佳，过量会导致抗体取向混乱与抗原结合位点减少。

3.3 免疫传感器构建与表征

通过LPA自组装层与EDC/NHS活化共价固定抗体，表面覆盖率达92%。SEM-EDX显示传感器表面元素（C、N、O、S、Co、Cu、Au）分布均匀，成功构建分层结构。

3.4 阻抗检测条件优化

在DC电位0.9 V、抗体浓度40 μg/mL、识别时间15分钟、pH 7.4条件下，传感器对Hla的响应最优。EIS信号随Hla浓度增加而升高，特异性实验表明其对抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、葡萄糖等干扰物无响应。

3.5 校准曲线与实际样本检测

传感器动态范围为0.000001–0.05 mg/mL，检测限（LOD）为0.01 ng/mL（R²=0.991）。在加标食品样本中回收率为96.0–107%，证实其在复杂基质中的可靠性。

结论与意义

本研究开发的免疫传感器整合了Co₃O₄-CuO的电催化活性、MWCNTs的高导电性与AuNPs的生物固定化优势，实现了对Hla的超灵敏、无标记检测。其性能优于现有SPR与间接检测方法，具备便携、快速（15分钟响应）、稳定性高（8周内信号保持94%）及重现性好（CV=2.3%）等特点。该技术为食品安全监测与临床病原毒素检测提供了高效解决方案，尤其适用于现场快速筛查。未来可进一步拓展至其他细菌毒素的多重检测领域。