乳酸化修饰通过ALKBH5-RNF123-PKM2信号轴加剧糖尿病视网膜病变中Müller细胞活化的机制研究

《Journal of Translational Medicine》：Lactylation-induced ALKBH5 targets RNF123 to worsen retinal Müller cell activation through PKM2-regulated Glycolysis in diabetic retinopathy

本研究针对糖尿病视网膜病变(DR)中Müller细胞异常活化的机制展开探索，发现乳酸通过组蛋白乳酸化上调ALKBH5表达，降低RNF123 mRNA的m6A修饰稳定性，抑制RNF123对PKM2的泛素化降解，增强糖酵解，形成正反馈循环，最终加剧Müller细胞活化。该研究揭示了"代谢-表观遗传-泛素化"交叉调控新机制，为DR治疗提供新靶点。

　　

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)作为糖尿病最常见的微血管并发症，已成为全球工作年龄人群视力丧失的主要原因。随着糖尿病患病率的持续攀升，DR的防治面临严峻挑战。在DR的复杂病理过程中，视网膜Müller细胞（视网膜主要胶质细胞）的异常活化被认为是关键环节。高糖(high glucose, HG)环境诱导Müller细胞转化为反应性表型，伴随炎症因子释放增加、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)上调、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)下调等特征，最终导致血视网膜屏障破坏和神经元损伤。然而，驱动Müller细胞活化的深层分子机制，特别是代谢重组与表观遗传、蛋白翻译后修饰之间的交互对话，仍有待深入揭示。

近期发表于《Journal of Translational Medicine》的一项研究，由Luo等科学家团队完成，深入探讨了乳酸化修饰诱导的ALKBH5通过靶向RNF123，在PKM2调控的糖酵解通路中恶化糖尿病视网膜病变中Müller细胞活化的新机制。该研究不仅揭示了DR病理进展中的一条新颖信号轴，更为干预策略的开发提供了潜在靶点。

研究者综合运用生物信息学分析、细胞模型（人视网膜Müller细胞系MIO-M1）、动物模型（链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠）以及多种分子生物学技术（包括Co-IP、Ubiquitination assay、MeRIP-qPCR、ChIP等）。通过对GEO数据库中DR患者和糖尿病小鼠视网膜芯片数据的挖掘，发现E3泛素连接酶RNF123在DR中表达下调。

RNF123过表达抑制HG诱导的MIO-M1细胞活化

研究发现，在DR患者、糖尿病小鼠视网膜以及HG处理的MIO-M1细胞中，RNF123的表达均显著降低。在MIO-M1细胞中，HG刺激导致细胞活力、迁移能力、细胞外酸化率(extracellular acidification rate, ECAR)、乳酸产量以及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平升高，同时GFAP表达上调而GS表达下调，这些变化均提示Müller细胞发生病理活化和糖酵解增强。重要的是，过表达RNF123能够有效逆转HG诱导的这些病理表型。

RNF123通过糖酵解调控Müller细胞活化

为进一步验证RNF123的功能，研究者敲低了MIO-M1细胞中的RNF123表达。结果显示，RNF123敲低本身即可模拟HG的效应，促进细胞活化、迁移、炎症反应和糖酵解。而使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose, 2-DG)处理，能够逆转RNF123敲低所诱导的细胞活化，表明RNF13通过调控糖酵解通路影响Müller细胞的功能。

RNF123与PKM2相互作用并诱导其泛素化

通过串联亲和纯化(tandem affinity purification)和质谱分析，研究者发现糖酵解关键酶M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2, PKM2)是RNF123的相互作用蛋白。Co-IP实验证实了RNF123与PKM2之间的直接结合。机制探索表明，RNF123不影响PKM2的mRNA水平，但能促进PKM2蛋白的K48连接的多聚泛素化修饰，进而通过蛋白酶体途径加速其降解。点突变实验进一步确定PKM2的K115和K151位点是RNF123介导的K48连接泛素化的关键位点。功能回复实验证明，过表达PKM2可以逆转RNF123过表达对HG诱导的Müller细胞活化和糖酵解的抑制作用，确立了RNF123-PKM2信号轴的下游作用。

P<0.01,*P<0.001 vs.IgG,NG,NG+shNC,or NG+vector.#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs.HG+shNC or HG+vector'>

ALKBH5以m⁶A依赖方式调控RNF123 mRNA稳定性

研究者进一步探究了HG条件下RNF123表达下调的上游机制。结果显示，HG处理降低了MIO-M1细胞中总的m⁶A修饰水平以及RNF123编码区(coding sequence, CDS)的特异性m⁶A修饰。HG上调了m⁶A去甲基化酶ALKBH5的表达，而对FTO（另一种去甲基化酶）无显著影响。敲低ALKBH5可增加全局和RNF123 CDS区域的m⁶A水平，提升RNF123 mRNA的稳定性及其蛋白表达。另一方面，过表达m⁶A阅读蛋白IGF2BP1也能增强RNF123 mRNA的稳定性。RNA免疫共沉淀(RIP)实验证实了IGF2BP1与RNF123 mRNA的结合。这些结果说明ALKBH5通过去甲基化作用降低RNF123 mRNA的m⁶A修饰，削弱了IGF2BP1介导的mRNA稳定性，从而导致RNF123蛋白水平下降。

乳酸通过组蛋白乳酸化调控ALKBH5表达

研究揭示了代谢物乳酸在表观遗传层面的上游调控作用。HG刺激导致MIO-M1细胞内乳酸积累和组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化(histone H3 lysine 18 lactylation, H3K18la)修饰水平升高。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验显示，H3K18la在ALKBH5启动子区的富集增加。使用乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A, LDHA)抑制剂FX-11处理，可降低乳酸产量、H3K18la富集以及ALKBH5的表达，同时使RNF123表达回升。更重要的是，过表达组蛋白H3K18位点突变体(H3K18R)可模拟FX-11的效应，抑制HG诱导的ALKBH5上调和Müller细胞活化。这证实了乳酸通过促进H3K18la修饰，进而转录激活ALKBH5表达。

ALKBH5-RNF123-PKM2调控轴的作用验证

为了确认整个信号轴的功能连贯性，研究者在MIO-M1细胞中进行了联合干预实验。敲低ALKBH5能够缓解HG诱导的细胞活化、糖酵解和炎症反应，表现为细胞活力、迁移、ECAR、乳酸产量、炎症因子水平下降，同时RNF123表达上调而PKM2表达下调。然而，当同时敲低RNF123时，ALKBH5敲低带来的保护效应被显著削弱。这证明ALKBH5确实是通过调控RNF123来发挥其对Müller细胞活化的影响。

体内实验验证

最后，研究在链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病大鼠模型中验证了上述发现。与体外结果一致，糖尿病大鼠视网膜组织出现变薄、结构紊乱等病理改变，同时伴有ALKBH5、PKM2、H3K18la、GFAP表达上调，以及RNF123、GS表达下调，乳酸和炎症因子水平升高。使用FX-11处理可改善这些病理变化，而玻璃体腔内注射shRNF123载体则加重了视网膜损伤，并且部分逆转了FX-11的保护作用。这有力地证明了乳酸-ALKBH5-RNF123-PKM2轴在糖尿病视网膜病变发生发展中的关键作用。

本研究首次系统地揭示了在糖尿病视网膜病变中，乳酸堆积通过诱导组蛋白H3K18乳酸化修饰，上调ALKBH5表达；ALKBH5通过去m⁶A修饰降低RNF123 mRNA稳定性，减少RNF123蛋白表达；RNF123的减少削弱了对PKM2的泛素化降解，导致PKM2积累并增强糖酵解通量，进而产生更多乳酸，由此形成一个自我放大的正反馈循环，持续驱动Müller细胞的病理活化、炎症反应及视网膜损伤。

该研究的创新性在于构建了一个连接代谢重编程（糖酵解/乳酸产生）、表观遗传调控（组蛋白乳酸化/m⁶A RNA甲基化）和蛋白质翻译后修饰（泛素化降解）的交叉调控网络。所阐明的"乳酸-ALKBH5-RNF123-PKM2"信号轴不仅深化了对DR分子机制的理解，更重要的是揭示了ALKBH5、RNF123等作为潜在治疗靶点的价值。干预此轴上的关键节点（如抑制LDHA活性、靶向ALKBH5或稳定RNF123），可能为打破DR病理进程中的恶性循环、开发新的治疗策略提供思路。这项研究为理解代谢性疾病中代谢物如何通过表观遗传机制精确调控基因表达和细胞功能提供了新颖的范式，具有重要的理论意义和潜在的转化价值。