血清细胞外囊泡SFTPB作为特发性肺纤维化疾病活动性新型生物标志物的蛋白质组学研究

《Journal of Translational Medicine》：Serum vesicle biomarkers reflect the disease activity of idiopathic pulmonary fibrosis

本研究针对特发性肺纤维化(IPF)疾病异质性大、缺乏有效生物标志物的临床难题，通过数据非依赖性采集(DIA)蛋白质组学技术系统分析血清细胞外囊泡(EVs)蛋白质谱，发现19个IPF相关蛋白中肺表面活性蛋白B(SFTPB)不仅诊断效能优于现有标志物KL6(AUROC=0.97)，且与纤维化范围、肺功能下降等疾病活动性显著相关。单细胞RNA测序进一步揭示SFTPB在IPF肺组织SCGB3A2+细胞中与TGF-β/SMAD通路协同表达，为IPF精准诊疗提供新视角。

　　

在呼吸系统疾病领域，特发性肺纤维化(IPF)始终是困扰临床医生的难题。这种以进行性肺纤维化为特征的疾病，患者预后极差，中位生存期仅3-5年。更棘手的是，IPF的临床病程呈现高度异质性——部分患者病情稳定多年，而另一些则快速进展为呼吸衰竭。这种差异源于IPF复杂的病因网络，涉及遗传易感性、环境因素、异常修复反应等多重机制的交织作用。

目前IPF的诊断和监测主要依赖高分辨率CT和肺功能检查，但前者辐射暴露限制频繁使用，后者敏感性不足难以捕捉早期变化。临床亟需能够反映个体化疾病活动度的生物标志物，而血液样本因其易获取、可重复的特点成为理想来源。然而，传统血清蛋白质组学面临巨大挑战：仅22种高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）就占据总蛋白量的99%，严重掩盖了疾病相关低丰度蛋白的信号。

为突破这一技术瓶颈，日本大阪大学的研究团队将目光投向血清细胞外囊泡(EVs)。这些纳米级脂质双层囊泡如同细胞间的"分子快递"，携带蛋白质、核酸等生物活性物质，参与细胞间通讯。更重要的是，EVs能有效避免血清蛋白酶降解，且富含组织特异性蛋白，为疾病生物标志物挖掘提供独特窗口。该团队在《Journal of Translational Medicine》发表的最新研究，通过前沿蛋白质组学技术揭示血清EVs中的SFTPB可作为IPF疾病活动性的优异生物标志物。

研究采用数据非依赖性采集(DIA)质谱技术对发现队列（127例IPF患者和34例健康对照）的血清EVs进行非靶向蛋白质组分析，鉴定出2420种蛋白质。通过病例对照关联分析发现19个IPF相关蛋白，其中16个表达上调，3个下调。在独立验证队列（20例IPF和22例对照）中，SFTPB、BPIFB1和PPIA三个蛋白显示出与发现队列一致的变化趋势。尤为重要的是，SFTPB在诊断IPF时曲线下面积(AUROC)达0.97，特异性为1.00，显著优于临床常用标志物KL6(AUROC=0.89)。此外，研究还通过蛋白质共表达网络分析发现补体系统上游成分与IPF显著相关，并通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和免疫组化验证了SFTPB的细胞来源及病理意义。

血清EVs蛋白质与IPF的关联特征

研究人员从不足50μL血清中成功鉴定出2420种EVs蛋白，IPF患者与健康对照的EVs数量、大小及标志蛋白CD9表达均无显著差异。关联分析识别出的19个IPF相关蛋白中，SFTPB关联最强（效应值=4.72，P=5.0×10^-25）。通路富集分析显示这些蛋白显著富集于肺表面活性物质代谢和细胞粘附分子结合通路。验证队列中SFTPB、BPIFB1和PPIA的重复验证证实了结果的可靠性。ROC分析进一步显示SFTPB的诊断效能超越KL6，且EVs中的SFTPB比血清游离SFTPB更具敏感性。

血清EVs蛋白的组织表达特征

通过人类蛋白质图谱数据库分析2302个血清EVs蛋白的组织表达模式，发现约半数蛋白具有组织特异性（Tau分数>0.8）。值得注意的是，19个IPF相关蛋白中肺特异性蛋白比例显著高于背景（P=0.0019），包括SFTPA2、SFTPB、CCL18和SCGB3A1等。这一发现证实血清EVs能有效捕获肺组织特异性信息，为无创生物标志物开发提供理论基础。

补体蛋白与IPF的模块化关联

蛋白质共表达网络分析识别出10个功能模块，其中紫色模块（富含C1QA、C1QB、C1QC等补体系统上游成分）与IPF显著相关。超几何检验显示该模块显著富集于补体激活通路（FDR=3.6×10^-15），基因集富集分析(GSEA)进一步在全蛋白质组水平验证了这一发现。这表明补体系统异常激活可能是IPF纤维化进程的重要机制之一。

IPF相关蛋白的临床意义与异质性

通过蛋白质相互作用网络分析，发现本研究鉴定的蛋白与已知IPF相关基因存在广泛连接，涉及表面活性成分、宿主防御、炎症等多个生物学类别。临床关联分析显示SFTPB与CT纤维化范围（P=3.7×10^-4）、进展表型（P=0.0074）和肺功能下降（%FVC，P=0.034）显著相关，而BPIFB1和补体模块主要与影像学改变相关。值得注意的是，不同IPF患者中这些标志物的表达水平存在明显异质性，提示其可能用于患者内型分型。

SFTPB的疾病特异性验证

Western blot分析显示SFTPB在IPF和慢性过敏性肺炎(CHP)等纤维化疾病中特异性升高，而在肺癌、慢性阻塞性肺病等非纤维化疾病中无显著变化。免疫组化证实IPF肺组织中SFTPB在肺泡上皮细胞、巨噬细胞及纤维化区域再生气道上皮细胞中高表达。

IPF肺中SFTPB的主要产生细胞

对12例IPF和10例对照肺组织的单细胞测序数据（89,326个细胞）分析发现，SCGB3A2⁺细胞簇在IPF肺中显著扩增（FDR<0.1）。虽然正常肺中SFTPB主要表达于AT2细胞，但IPF肺中SCGB3A2⁺细胞成为SFTPB的主要来源之一。差异表达分析显示IPF肺SCGB3A2⁺细胞中SFTPB表达上调1.64倍（P=0.031）。共表达网络分析进一步揭示SFTPB在SCGB3A2⁺细胞中与TGF-β/SMAD通路基因（SMAD3、MYC、WWTR1等）显著共表达，而在AT2细胞中无此特征。免疫荧光染色验证了IPF肺组织中SFTPB⁺SCGB3A2⁺双阳性细胞的存在。

本研究通过系统性的蛋白质组学与单细胞转录组学整合分析，确立了血清EVs在IPF生物标志物研究中的重要价值。研究发现不仅证实SFTPB作为IPF诊断和疾病活动性标志物的优越性能，还深入揭示了其与SCGB3A2⁺细胞中TGF-β/SMAD通路的功能关联，为理解IPF异质性提供了新的分子视角。血清EVs捕获的多种蛋白标志物（SFTPB、BPIFB1和补体成分）从疾病早期阶段就开始升高，且在不同患者中呈现异质性表达模式，这为未来实现IPF精准分型和个体化治疗奠定基础。尽管EVs分离技术标准化等挑战仍需解决，但本研究展示的多组学整合策略为复杂疾病生物标志物开发提供了范本，推动呼吸系统疾病诊疗向无创、动态、精准方向迈进。