KBTBD11通过泛素化降解ENO1抑制肝细胞癌糖代谢的新机制

《Journal of Translational Medicine》：KBTBD11 suppresses hepatocellular carcinoma by targeting ENO1-mediated glycolysis

本研究针对肝细胞癌(HCC)中糖代谢重编程的调控机制不明问题，开展了KBTBD11通过泛素-蛋白酶体途径降解ENO1抑制糖酵解的机制研究。研究人员通过体内CRISPR筛选发现KBTBD11为候选抑癌基因，证实其与ENO1相互作用并促进其泛素化降解，从而抑制ATP生成、乳酸产生并诱导ROS积累和细胞凋亡。该研究揭示了蛋白质降解系统与代谢调控的新联系，为靶向HCC代谢脆弱性提供了新策略。

　　

在癌症研究领域，代谢重编程已成为最引人注目的特征之一。其中，Warburg效应（即肿瘤细胞即使在氧气充足条件下仍优先选择糖酵解供能）在肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)的发生发展中扮演着关键角色。作为全球癌症相关死亡的主要原因之一，HCC患者的预后仍然不容乐观，尤其是晚期患者面临治疗选择有限、复发率高和耐药性强等挑战。这种临床困境促使科学家们不断探索HCC进展的分子通路，以期发现新的治疗靶点。

在糖酵解通路中，烯醇化酶1(Enolase 1, ENO1)催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是糖酵解过程中的关键步骤。研究表明，ENO1在包括HCC在内的多种癌症中高表达，与增强的糖酵解活性和肿瘤侵袭性密切相关。然而，在肝癌中调控ENO1表达和稳定性的上游机制尚不完全清楚。

蛋白质稳态，特别是泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)，作为癌症生物学中维持蛋白质平衡的关键机制，通过选择性降解靶蛋白调控包括代谢在内的多种细胞过程。其中，BTB-Kelch家族蛋白作为E3泛素连接酶复合物的底物适配器，在决定底物特异性方面发挥重要作用。KBTBD11作为该家族中一个相对未被充分研究的成员，其在癌症生物学中的作用，特别是在HCC代谢调控中的功能，仍有待阐明。

在这项发表于《Journal of Translational Medicine》的研究中，Liu等人通过系统性研究，揭示了KBTBD11作为新型肿瘤抑制因子，通过调控ENO1介导的糖酵解通路抑制HCC进展的分子机制。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过体内全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定HCC代谢调控因子；利用蛋白质相互作用分析（包括免疫共沉淀、质谱分析和截断突变体分析）验证KBTBD11与ENO1的直接结合；通过代谢通量分析（包括细胞外酸化率检测、ATP和乳酸定量、¹³C-葡萄糖示踪）评估糖酵解活性；借助临床样本分析（TCGA-LIHC数据库、GEO数据集和包含72对HCC及癌旁组织的组织微阵列）验证KBTBD11的临床相关性；使用体内外功能实验（包括Transwell实验、克隆形成实验、3D球体培养和原位肝癌小鼠模型）评估KBTBD11的肿瘤抑制功能。

KBTBD11被鉴定为肝细胞癌的潜在肿瘤抑制因子

研究人员首先通过体内全基因组CRISPR-Cas9筛选策略，在原位HCC模型中寻找抑制肿瘤发展的基因。他们将携带CRISPR文库的Huh7-Cas9细胞植入小鼠肝脏，21天后收集肿瘤组织并进行sgRNA测序分析。与注射前对照(T1)相比，肿瘤组织中富集的sgRNA对应基因被认为是正选择基因，其缺失会赋予体内生长优势。分析结果显示，KBTBD11成为排名最高的候选基因，具有最高的β-score和一致的sgRNA富集。

KBTBD11在HCC中下调并与良好预后相关

为了评估KBTBD11在HCC中的临床意义，研究人员分析了多个独立数据集。Kaplan-Meier生存分析显示，高表达KBTBD11的患者具有更长的总生存期(OS)、无复发生存期(RFS)和无进展生存期(PFS)。对TCGA-LIHC数据和三个GEO数据集(GSE39791、GSE45267、GSE112790)的分析一致表明，与癌旁正常组织相比，HCC肿瘤组织中KBTBD11的mRNA水平显著降低。免疫组化结果进一步证实，72对HCC组织中KBTBD11蛋白表达明显下调。

KBTBD11抑制HCC细胞增殖和侵袭

功能实验表明，KBTBD11过表达显著抑制了Huh7和Hepa1-6细胞的迁移、侵袭能力和克隆形成，而敲低KBTBD11则产生相反表型。Western blot验证了KBTBD11操作的效率。3D球体培养实验进一步证实，KBTBD11过表达阻碍了肿瘤球体的生长。

KBTBD11过表达抑制体内肿瘤生长并延长生存期

在体内实验中，研究人员建立了Hepa1-6细胞原位肝癌模型。生物发光成像显示，KBTBD11过表达组小鼠肝内信号显著低于对照组。大体肝脏形态显示KBTBD11-OE组肿瘤结节更小。生存分析表明KBTBD11-OE小鼠总生存期显著延长。组织学检查显示KBTBD11-OE组肿瘤侵袭特征减少，血清ALT和AST水平降低，表明肝损伤减轻。

KBTBD11与ENO1相互作用调控代谢通路

机制上，转录组分析显示KBTBD11过表达导致糖酵解相关信号通路上调。免疫共沉淀-质谱分析鉴定出46个可能与KBTBD11相互作用的候选蛋白，基因富集分析显示这些蛋白显著富集于代谢过程。ENO1作为糖酵解关键酶，成为基于谱图丰度和代谢相关性的顶级候选者。蛋白质-蛋白质对接预测了KBTBD11与ENO1之间的稳定相互作用界面。这些发现通过免疫共沉淀、免疫荧光和邻近连接实验(Proximity Ligation Assay, PLA)得到验证。

KBTBD11通过泛素-蛋白酶体途径促进ENO1降解

研究人员进一步探讨了KBTBD11调控ENO1蛋白稳定性的机制。KBTBD11过表达抑制了Huh7细胞中ENO1水平，而MG132（蛋白酶体抑制剂）处理以时间依赖性方式引起ENO1积累，并逆转了KBTBD11诱导的ENO1下调。放线菌酮追踪实验显示KBTBD11过表达缩短了ENO1半衰期，而其敲低则延长了半衰期。泛素化实验证明KBTBD11显著增强了ENO1的多泛素化。结构域分析表明，Kelch结构域对ENO1结合至关重要，而BTB结构域有助于稳定复合物。

KBTBD11抑制HCC细胞中葡萄糖来源的能量代谢

稳定同位素示踪代谢通量分析显示，KBTBD11过表达并未显著改变早期糖酵解中间产物（如葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸）水平，但显著降低了下游中间产物（包括2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乳酸）。这表明KBTBD11通过干扰ENO1催化的代谢物转化来抑制糖酵解通量。

KBTBD11抑制HCC细胞的糖酵解能力

细胞外酸化率分析表明，KBTBD11过表达显著抑制了Huh7和Hepa1-6细胞的糖酵解能力，而其敲除则增强了糖酵解通量。相应地，细胞内ATP水平和乳酸产量也呈现类似变化趋势。ENO1重新表达部分恢复了ECAR、ATP水平和乳酸产量。ENOblock（ENO1药理抑制剂）处理重现了KBTBD11过表达的代谢抑制表型，且两者联合处理未产生叠加效应。细胞活力实验表明，KBTBD11过表达和ENOblock处理均显著损害细胞增殖。

KBTBD11诱导的糖酵解抑制促进ROS积累和凋亡

KBTBD11过表达增加了Huh7和Hepa1-6细胞中的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平，而ENO1重新表达减弱了这种增加。Annexin V/碘化丙啶染色显示，KBTBD11过表达显著增加了细胞凋亡。这表明KBTBD11通过诱导糖酵解抑制产生的氧化应激促进细胞凋亡。

研究结论与意义

该研究通过系统性实验证实KBTBD11作为HCC中以前未被认识的肿瘤抑制因子，通过泛素-蛋白酶体途径降解ENO1，从而抑制糖酵解代谢、升高氧化应激并诱导肿瘤细胞凋亡。这一调控轴将泛素-蛋白酶体系统与代谢调控联系起来，为理解HCC进展提供了新的机制见解。

研究的意义在于揭示了KBTBD11-ENO1轴作为HCC代谢脆弱性的潜在治疗靶点。考虑到直接抑制代谢酶常导致全身毒性，恢复KBTBD11功能或模拟其活性可能为MYC和ENO1驱动的肿瘤提供更选择性的糖酵解抑制策略。此外，基于蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)或分子胶技术的治疗策略，通过KBTBD11介导的机制或合成替代物增强ENO1降解，可能扩展针对代谢活性肝癌的治疗手段。

该研究不仅深化了对HCC代谢重编程机制的理解，也为开发针对癌症代谢脆弱性的新型治疗策略提供了重要理论基础。KBTBD11作为连接蛋白质降解系统与代谢调控的关键分子，在未来肝癌精准治疗中具有重要的转化医学价值。