Si-A/PUE@HA水凝胶通过单细胞RNA测序调控骨软骨缺损微环境促进软骨再生的机制研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Investigation of the effects of Si-A/PUE@HA hydrogels on the osteochondral defect microenvironment based on single-cell RNA sequencing

本研究针对骨软骨缺损修复中软骨再生能力有限及免疫微环境失衡的难题，开发了新型Si-A/PUE@HA复合水凝胶。通过多模式交叉linking技术构建的该水凝胶不仅具备优异的机械性能和生物相容性，还能通过调控巨噬细胞极化（促进M2表型）和激活PI3K-AKT通路，显著增强BMSCs的软骨向分化（上调Acan、Sox9、Col2a1表达）。动物实验证实其可促进透明软骨样组织形成并改善缺损修复质量，单细胞测序进一步揭示了其免疫调节与软骨生成的协同作用，为骨关节再生医学提供了新策略。

关节软骨损伤是骨科领域的世界性难题，由于软骨组织缺乏血管分布，自我修复能力极差。传统的微骨折术、软骨细胞移植等方法往往只能形成力学性能较差的纤维软骨，无法实现真正的生物学修复。更为棘手的是，损伤后的炎症微环境会进一步阻碍修复进程，其中M1型巨噬细胞主导的促炎反应与M2型巨噬细胞的抗炎/修复功能失衡是关键障碍。面对这一挑战，研究人员将目光投向了组织工程水凝胶——一种能模拟细胞外基质（ECM）的三维网络结构材料。

近日发表于《Journal of Nanobiotechnology》的研究中，团队创新性地将硅烷（silane）、精氨酸（arginine）、葛根素（puerarin）与透明质酸（HA）通过物理/化学交联结合，构建出多功能复合水凝胶Si-A/PUE@HA。该材料不仅具备可注射性和组织粘附性，其缓释的葛根素更被证实具有抗氧化和免疫调节活性。研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）等技术，系统揭示了该水凝胶通过重塑免疫微环境促进软骨再生的双轨机制。

关键技术方法包括：通过扫描电镜（SEM）和流变学分析表征水凝胶微观结构与力学性能；利用CCK-8/Live-Dead染色评估BMSCs增殖活性；通过体外软骨 pellet 培养模型（含TGF-β3诱导）和大鼠股骨滑车缺损模型（Micro-CT/组织染色评估）验证成软骨效能；采用scRNA-seq解析细胞群体动态变化，并结合Western blot验证PI3K-AKT通路激活。

Structural and physicochemical characterization of the Si-A/PUE@HA hydrogel

水凝胶呈现多孔网状结构（孔隙率>80%），硅烷交联使储能模量（G'）显著提升至10kPa级别，优于单纯HA水凝胶。XPS证实硅元素成功引入，EDS mapping显示各组分分布均匀。14天内葛根素持续释放率达70%，且对皮肤、金属等基质表现出强粘附性。

In vitro cytocompatibility

BMSCs在水凝胶中培养7天后存活率>95%，BrdU阳性细胞数较对照组增加2.3倍。DCFH-DA检测显示其可清除H₂O₂诱导的ROS过量生成，划痕实验证实能加速细胞迁移（24小时愈合率提高至89%）。

Promotion of in vitro chondrogenesis in BMSCs

成软骨诱导21天后，Si-A/PUE@HA组Alcian blue/Safranin O染色深度较NC@HA组增强3倍，Ⅱ型胶原免疫组化阳性面积占比达68%。qPCR显示成软骨标志基因Acan、Sox9、Col2a1表达上调4-6倍，而纤维化标记Col1a1下降至对照组的30%。

In vitro modulation of macrophage polarization

LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞经水凝胶处理后，流式细胞术检测CD86⁺ M1细胞比例从42%降至15%，CD163⁺ M2细胞比例从21%升至55%。ELISA显示TNF-α、IL-6等促炎因子分泌减少，IL-10、IL-1ra等抗炎因子增加。

Si-A/PUE@HA hydrogel enhances in vivo cartilage regeneration

大鼠缺损模型Micro-CT显示12周时Si-A/PUE@HA组骨体积分数（BV/TV）达0.58，显著高于模型组（0.23）。组织学评分（ICRS/MOHS）接近正常软骨，新生组织与宿主软骨整合良好，且Col2免疫荧光强度提升4.2倍。

Si-A/PUE@HA hydrogel modulates immune cell populations and macrophage polarization

scRNA-seq鉴定出6个巨噬细胞亚群，水凝胶组促炎型Mmp12⁺巨噬细胞占比从28%降至9%，而修复型Tiparp⁺/Vcam1⁺群体扩增。拟时序分析显示细胞分化轨迹向抗炎方向偏移。

Si-A/PUE@HA composite hydrogel promotes cartilage regeneration by activating the PI3K-AKT pathway

Western blot证实水凝胶组p-AKT/AKT比值升高2.8倍，下游mTOR表达同步上调。同时软骨降解酶MMP-13、Adamts-5蛋白水平下降60%，提示其通过协同激活合成代谢、抑制分解代谢促进修复。

综上，该研究不仅开发了一种兼具力学支撑与免疫调控功能的智能水凝胶，更通过多组学分析阐明了材料-细胞-微环境互作机制。其双轨策略（直接促进软骨生成+间接优化免疫微环境）为复杂组织再生提供了新范式，尤其对关节炎、运动损伤等病变的临床治疗具有转化潜力。未来需在大动物模型及长期安全性方面开展深入验证。