基于肿瘤原位液体DNA追踪胶质瘤一线治疗演化进程及复发监测研究

《Frontiers in Oncology》：Tumor DNA from tumor in situ fluid was used to track evolution of glioma under first-line treatment

本研究创新性地利用肿瘤原位液体（TISF）DNA测序技术，动态追踪了60例胶质瘤患者在一线治疗（手术及术后放化疗）压力下的基因组演化全景。研究揭示了术后不同阶段（0-35天、36-120天、>120天及复发时）肿瘤基因图谱的显著异质性，证实TISF-DNA与复发肿瘤组织突变检测具有高度一致性（VAF相关性R2 = 0.8737）。关键发现包括：TISF-DNA可较影像学更早预警分子层面复发（VAF升高），并能有效鉴别假性进展。TP53、NF1、EGFR、PTEN、SETD2等高频突变基因在复发过程中持续存在，提示其为驱动事件。该研究表明TISF-DNA液态活检为胶质瘤术后微小残留病灶（MRD）监测、克隆演化追踪及临床治疗决策提供了重要工具。

　　

引言

胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，其复发后的标准治疗方案尚未明确。近年研究表明，胶质瘤内部存在显著的表观遗传和环境异质性，导致细胞水平上极端的表型异质性，这为肿瘤提供了多种治疗抵抗机制，使得复发胶质瘤的治疗复杂化。液体活检技术，特别是基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测，在监测最小残留病灶（MRD）、指导辅助免疫治疗、早期发现肿瘤复发以及追踪肿瘤进化动态和异质性方面展现出巨大潜力。然而，在胶质瘤领域的研究仍相对有限。相较于血液ctDNA，脑脊液（CSF）来源的ctDNA对胶质瘤更具代表性，但其阳性率往往在肿瘤负荷较高时才提升，且可能丢失治疗压力下的基因组进化信息。肿瘤原位液体（TISF）作为一种新型的生物标志物，克服了组织活检的局限性，能够实现快速、微创、多次连续采样，从而在时间维度上捕捉肿瘤异质性。TISF-DNA对低肿瘤负荷更为敏感，其采集过程甚至比腰椎穿刺更具微创性。本研究旨在通过连续TISF-DNA检测，监测胶质瘤在一线治疗不同阶段的基因突变情况，并探讨其与临床结局的潜在关联。

材料与方法

患者与样本采集

这项前瞻性观察性研究于2016年1月1日至2022年1月31日在河南省人民医院进行。研究纳入了60例世界卫生组织（WHO）II-III级胶质瘤患者。在原发性肿瘤切除后，于残留腔内置入液体储液囊，用于术后TISF样本的采集。原发性肿瘤样本通过手术获取，术后治疗遵循NCCN指南。TISF样本在术后不同时间点采集：术后0-35天、36-120天以及120天以后（根据RANO标准判定肿瘤进展时）。所有患者在每次随访时均进行MRI检查。通过3D Slicer软件手动分割MRI图像确定肿瘤体积，肿瘤全切除率低于90%视为有残留。5例患者在影像学复发后接受了第二次肿瘤切除手术。新鲜肿瘤组织经神经病理学家确认，其HE染色标本中肿瘤细胞含量超过70%。同时，采集每位患者的匹配血液样本用于过滤胚系突变。研究设计了脑肿瘤基因Panel用于筛查肿瘤突变。

肿瘤相关DNA的靶向测序分析

所有临床TISF样本和肿瘤组织样本均采用新一代测序技术进行检测。使用商业化试剂盒提取基因组DNA和细胞游离DNA（cfDNA）。分离的DNA经片段化后，使用KAPA HTP文库制备试剂盒构建文库，并在Novaseq高通量测序平台上进行测序。检测阈值设定为等位基因分数（VAF）≥ 0.1%且测序深度≥ 4个 reads。利用数据库排除良性突变和多态性位点，最后使用ANNOVAR等工具对检测到的突变进行基因注释。

统计学分析

使用GraphPad Prism进行绘图，TBtools生成热图，SPSS进行统计学检验。分类变量采用Fisher精确检验，连续变量采用Wilcoxon检验、Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis检验。

结果

患者基线特征

研究共分离了60例原发性中枢神经系统胶质瘤患者的TISF-DNA。患者平均年龄51.5岁（范围21-78岁），肿瘤分级为WHO II-IV级。肿瘤主要位于额叶、颞叶等部位。原发性肿瘤基因组代表了手术前胶质瘤的特征。术后0-35天的样本代表了手术切除后早期肿瘤腔内微小残留病灶的基因组特征。术后36-120天的样本代表了接受化疗（低级别）和放化疗（高级别）的胶质瘤基因组特征。术后120天以上的样本代表了治疗期间进一步化疗时的基因组特征。26例患者在采样时发现影像学肿瘤复发。

一线治疗下不同阶段胶质瘤的基因组图谱

总体而言，治疗过程不同阶段的突变基因存在差异但也有相似之处。在原发性肿瘤中，最常见的突变基因是TP53、IDH1、PTEN、CIC、EGFR、NF1。在术后0-35天阶段，高频突变基因为NF1、SETD2、CIC、TP53、BRCA2、GNAS。在术后36-120天治疗阶段，高频突变基因为NF1、TP53、TSC2、PTCH1、BRCA1、FAT1。在术后120天以上阶段，高频突变基因为TP53、SETD2、IDH1、NF1、NOTCH1、RELA。在影像学复发时，突变率较高的基因包括TP53、NF1、SETD2、EGFR、FAT1、PTEN。值得注意的是，在整个治疗过程中，TP53和NF1持续高频突变，EGFR、PTEN和SETD2也保持较高突变频率，提示它们可能是肿瘤复发时保留的驱动突变。胶质瘤在术后治疗的不同阶段表现出高度异质性，共享突变率仅为15.75%，私有突变率高达84.25%。对14例连续监测的患者分析发现，在高频突变基因中，仅EGFR、IDH和TP53在部分患者的所有监测样本中持续存在。许多在原发性肿瘤中发现的突变也存在于TISF-DNA中，如CIC、FAT1、NF1、NOTCH1和SETD2。更有趣的是，在许多患者中，TISF检测到了原发性肿瘤中未发现的突变。

一线治疗下基因组VAF的变化

研究发现，原发性肿瘤组织的VAF非常高，97.37%的突变VAF值大于1%，仅2.27%为低频突变。然而，在肿瘤切除后的早期阶段（35天内），87.84%的突变VAF值小于1%，仅12.16%的突变VAF大于1%。随着术后治疗的推进，VAF大于1%的突变比例在术后36-120天略有增加，至术后120天以上显著增加至30.42%。在复发患者的TISF样本中，VAF大于1%的突变比例总体略高，占30.84%。此外，研究还发现术后35天内较高的VAF可能与术后残留相关。影像学显示有显著残留的患者，其VAF高于影像学完全切除的患者。相比之下，术后治疗期间发生影像学复发的患者，其VAF高于未复发患者。

一线治疗下胶质瘤特定基因类型的变化

在TISF-DNA中，研究人员发现了错配修复（MMR）相关基因以及替莫唑胺相关的高突变特征。总体而言，随着胶质瘤术后治疗的推进和肿瘤进展，多重突变、MMR相关突变以及VAF > 5%的基因突变逐渐增加，携带这些突变的患者比例也逐步上升。所有患者术后均接受了替莫唑胺化疗。有趣的是，随着化疗的进行，并未发现替莫唑胺相关高突变频率的增加，也未发现携带此类突变患者数量的增加。因此，MMR相关突变和多重突变可能与治疗后胶质瘤复发相关。

连续监测胶质瘤患者的基因组特征

本研究对14例患者进行了连续TISF采样监测，并将其分为非复发组和复发组。与上述结论相似，两组患者在胶质瘤切除早期均观察到低频突变分布。然而，在复发组中，随着时间推移，部分基因的突变频率在TISF-3样本中有所增加，而非复发组中则未观察到这种现象。随着胶质瘤的术后进展，TISF-DNA中的私有突变远多于原发性组织。TISF与原发性组织共享的突变逐渐减少，在TISF-1中共享比例最高，并随着肿瘤进展而下降。TISF-DNA样本中，TISF-1与TISF-3共享的突变比例也较低。这表明术后早期的微小残留病灶可能更接近原发性肿瘤，而复发肿瘤与原发性肿瘤之间存在显著的异质性。

胶质瘤基因组变化的临床相关性

基于研究结果，总结了胶质瘤术后基因组变化与临床实践的相关性。研究发现，VAF的升高早于影像学阳性发现，表明在影像学尚未呈现阳性时，可能已存在肿瘤DNA水平的复发，这是复发的超早期表现。对6例有影像学复发表现的患者进行了第二次肿瘤切除，其中仅3例病理证实为肿瘤复发，他们的复发TISF中存在多重突变和高VAF值。另外2例患者表现为广泛的炎症和坏死组织，其TISF中未检测到突变。最后，研究总结了一线治疗下胶质瘤的进化模型：随着原发性肿瘤的手术切除，肿瘤驱动基因被移除，术后残留病灶阶段存在大量低频突变。在治疗压力下，突变VAF升高，此时影像学可能尚未显示阳性结果。随着肿瘤进一步进化，肿瘤复发驱动基因出现，导致肿瘤生长和影像学复发。这些结果表明，通过TISF-DNA可以有效检测胶质瘤的早期分子复发，为临床早期诊断和治疗复发提供了可能性。

讨论

尽管肿瘤活检仍是胶质瘤诊断的金标准，但基于TISF-DNA的液体活检克服了肿瘤活检的诸多局限性，并在临床应用中显示出优于血液和脑脊液来源ctDNA的优势。组织活检存在采样偏差、有创性及并发症风险。CSF-ctDNA是一种可行的方法，但在肿瘤切除后早期很难检测到，其阳性往往需要肿瘤负荷大、肿瘤进展或扩散至脑室系统等条件。这使得在胶质瘤进化早期检测基因组变化变得困难，更无法在影像学之前发现肿瘤DNA水平的复发。本研究对胶质瘤驱动基因异质性和复发的分析，为了解一线治疗全过程的基因组状态提供了重要见解。首先，在一线治疗背景下，肿瘤基因组的遗传突变在不同阶段存在差异。手术切除后早期，基因状态以低VAF突变为主。随着治疗推进，肿瘤多重突变增加，VAF升高。此外，观察到复发肿瘤组织样本检测到的突变与匹配的TISF样本高度一致，证明了TISF-DNA在胶质瘤系统治疗过程中检测肿瘤DNA变异的可靠性。研究还发现TISF-DNA可检测到肿瘤DNA VAF水平升高早于影像学阳性表现，即存在DNA水平的复发。同时，复发患者的TISF显示出与复发肿瘤组织相似的高频突变，而假性进展患者的TISF则表现为低频突变且组织检测为阴性，但影像学均呈阳性。这表明TISF-DNA可在临床实践中鉴别胶质瘤的假性进展，从而为医生提供治疗指导。

结论

本研究结果展示了一线治疗压力下胶质瘤在不同阶段的基因组状态和复发进程。确定连续TISF检测可用于追踪胶质瘤术后残留疾病、肿瘤复发和假性进展。它能够动态地为胶质瘤患者的临床管理提供指导，并推动胶质瘤相关研究的发展。