精氨酸介导的大肠杆菌Nissle 1917通过抑制巨噬细胞凋亡缓解鼠伤寒沙门菌诱导的肠道炎症

《Frontiers in Immunology》：Arginine-mediated inhibition of macrophage apoptosis by Escherichia coli nissle 1917 in Salmonella typhimurium-induced intestinal inflammation

本研究揭示了益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）通过其精氨酸代谢产物，调控巨噬细胞凋亡以缓解鼠伤寒沙门菌（S. Tm）诱导的肠道炎症的新机制。文章阐明了精氨酸通过抑制活性氧（ROS）生成、维持线粒体膜电位（ΔΨm）及阻断Caspase-3（CASPASE3）激活等途径，靶向核糖体蛋白S3（RPS3）与丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3（SRSF3）的相互作用，为细菌感染性肠炎提供了新的治疗靶点（如arcA基因、BCL2/BAX通路）。

　　

精氨酸代谢在鼠伤寒沙门菌感染中的差异

研究首先通过非靶向代谢组学分析了鼠伤寒沙门菌（S. Tm）感染小鼠结肠组织的代谢谱变化。与对照组相比，感染组存在146种差异表达代谢物，其中79种上调，67种下调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，氨基酸代谢途径，尤其是精氨酸代谢，发生了显著改变。通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）定量检测血液样本，发现感染小鼠体内的精氨酸和赖氨酸水平显著降低。对比较毒理学数据库（CTD）的分析揭示了克罗恩病（Crohn’s Disease）、溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis）和鼠伤寒沙门菌感染患者之间存在重叠的差异表达基因。KEGG富集分析（enrichKEGG）进一步指出，“精氨酸和脯氨酸代谢”是其中最显著的代谢通路之一。基因集富集分析（GSEA）也证实了感染小鼠结肠组织代谢物在精氨酸代谢通路中显著富集。这些发现表明，精氨酸在维持生理稳态和增强宿主抗感染防御中扮演着关键角色。

精氨酸介导EcN抑制鼠伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡

基于EcN在肠道炎症中的保护作用以及精氨酸在维持肠道稳态中的关键功能，研究假设EcN可能通过代谢产生精氨酸来发挥其治疗作用。研究通过同源重组技术设计了arcA基因敲除菌株（EcN-ΔarcA），并通过PCR验证了敲除效率。精氨酸浓度检测试剂盒的结果表明，arcA基因与EcN的精氨酸代谢密切相关。对RAW264.7细胞内精氨酸浓度的测量显示，EcN处理，尤其是EcN-ΔarcA菌株，能显著提高巨噬细胞内的精氨酸水平，这为宿主抵抗S. Tm感染创造了有利的代谢微环境。

在细胞功能层面，研究发现EcN预处理能降低S. Tm对RAW264.7细胞的粘附和侵袭率，但这种抑制作用与精氨酸积累无显著相关性。然而，EcN-WT干预导致细胞外细菌数量显著减少，而EcN-ΔarcA预处理则使这种有益效果更为明显，表明EcN对巨噬细胞胞外抗菌功能的调节依赖于对arcA基因的负调控，而精氨酸积累可能进一步增强了巨噬细胞介导的胞外细菌清除能力。

为阐明精氨酸在入侵后致病机制中的作用，研究系统评估了细胞内精氨酸积累是否调节EcN缓解S. Tm引发的巨噬细胞损伤的能力。光镜观察显示，S. Tm感染导致RAW细胞形态发生显著改变，出现膜崩解和边缘碎裂，而EcN预处理则能维持巨噬细胞膜的完整性。碘化丙啶（PI）染色结果表明，EcN-ΔarcA处理组的PI染色强度和阳性细胞数显著低于EcN-WT组，表明细胞膜完整性更好。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色检测染色质凝聚，结果显示EcN-WT组能显著减少S. Tm感染引起的核凝聚，而EcN-ΔarcA处理组的核凝聚程度更低。DNA降解检测也表明，EcN-WT和EcN-ΔarcA组均能在一定程度上减轻S. Tm感染引起的细胞内DNA片段化现象。

通过流式细胞术检测细胞凋亡，发现精氨酸积累条件下，巨噬细胞的存活率显著提高。JC-1检测线粒体膜电位（ΔΨm）的结果显示，与EcN-WT组相比，EcN-ΔarcA处理组的线粒体膜电位显著升高。Western blotting分析线粒体凋亡通路关键蛋白，结果表明，在精氨酸积累条件下，EcN抑制了S. Tm感染引起的巨噬细胞中B细胞淋巴瘤-2（BCL2）的下调，同时阻碍了Bcl-2相关X蛋白（BAX）表达的增强和CASPASE3的激活。

为了明确arcA对精氨酸水平的影响，研究进一步构建了arcA回补菌株EcN-ΔarcA::arcA，并通过PCR验证了其有效性。检测发现，与EcN-ΔarcA相比，回补菌株的精氨酸产量能力及其预处理细胞内的精氨酸水平均显著降低，再次证实了arcA与细菌精氨酸代谢水平的强相关性。细菌生长曲线表明arcA敲除不影响细菌生长。流式细胞术分析显示，与EcN-ΔarcA菌株相比，用EcN-ΔarcA::arcA预处理的细胞抑制S. Tm感染诱导凋亡的能力显著降低。同时，arcA回补后，EcN-ΔarcA抑制沙门菌感染诱导的肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）转录水平升高的能力也显著受损。这些结果共同强调了精氨酸在EcN作为抗S. Tm感染治疗剂中的潜在作用。

精氨酸抑制鼠伤寒沙门菌诱导的小鼠肠道巨噬细胞凋亡

接下来，研究探讨了精氨酸在EcN治疗S. Tm攻击小鼠模型中的作用。结果显示，与未处理的对照组相比，预先用EcN处理的小鼠肠道内S. Tm菌株的定植水平显著降低，且EcN-WT和EcN-ΔarcA预处理组之间的小鼠S. Tm定植量存在显著差异。在S. Tm连续感染条件下，施用EcN-ΔarcA能比EcN-WT更显著地减少肠道内S. Tm的定植。这些结果表明，精氨酸积累对于EcN预处理减少小鼠体内S. Tm定植的有益效果至关重要。

在连续感染模型中，EcN-WT组和EcN-ΔarcA组均能在一定程度上抑制模型组小鼠的体重下降。小鼠结肠的整体形态外观得到恢复。苏木精-伊红（H&E）染色显示，EcN-ΔarcA治疗组小鼠的淋巴细胞和粒细胞浸润较少，仅见少量肠上皮细胞脱落。免疫组织化学（IHC）检测凋亡标志物TNF-α和IL-6的水平，结果表明EcN-ΔarcA干预下由S. Tm引起的小鼠肠道炎症弱于EcN-WT治疗。免疫荧光（IF）分析显示，与EcN-WT相比，EcN-ΔarcA能更有效地抑制S. Tm感染诱导的结肠中Occludin蛋白表达的下调。与体外数据一致，EcN-ΔarcA治疗组巨噬细胞中cleaved-Caspase3的表达较低，这通过小鼠结肠中巨噬细胞与cleaved-Caspase3的免疫荧光共定位得以证实。这些发现表明，精氨酸可能在EcN调节宿主抗感染防御能力中起着关键作用。

精氨酸直接抑制鼠伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡

为了研究精氨酸是否直接有助于巨噬细胞防御S. Tm感染，研究用外源性精氨酸处理巨噬细胞。结果与之前发现一致，精氨酸预处理后，S. Tm对RAW264.7细胞的粘附和侵袭没有显著变化。但精氨酸预处理后，细胞感染后的胞外S. Tm数量显著减少。使用EGFP标记的S. Tm，荧光显微镜显示精氨酸处理的巨噬细胞内细菌载量显著降低。透射电子显微镜（TEM）证明精氨酸处理能保护线粒体超微结构，防止感染对照组中观察到的特征性肿胀、嵴破坏和空泡化。

使用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）定量检测活性氧（ROS）水平，显示精氨酸处理能剂量依赖性地降低S. Tm诱导的氧化应激，相应荧光强度减弱。流式细胞术分析证实精氨酸补充显著降低了感染期间的巨噬细胞凋亡率。PI染色结合RNase处理表明精氨酸能防止感染诱导的DNA降解。Mito-Tracker Green染色显示精氨酸处理阻止了S. Tm诱导的线粒体质量减少。线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的定量分析进一步证明，精氨酸补充能剂量依赖性地减轻感染介导的线粒体基因组耗竭。Western blotting分析证实精氨酸抑制了S. Tm感染细胞中线粒体凋亡通路的激活。这些结果证明，精氨酸在S. Tm挑战条件下对抑制巨噬细胞凋亡过程做出了积极贡献。

精氨酸通过靶向RPS3抑制巨噬细胞凋亡

为了更好理解精氨酸是否增强巨噬细胞防御S. Tm的能力，研究裂解RAW264.7细胞后，与生物素标记的精氨酸共同孵育，结合链霉亲和素磁珠下拉生物素标记的精氨酸及其结合蛋白，并通过质谱（MS）进行鉴定。KEGG富集分析显示，41种精氨酸结合蛋白对沙门菌感染有反应。对这些基因的富集分析表明，除细胞膜蛋白外，核糖体蛋白S3（RPS3）与精氨酸有很强的相互作用。研究进一步构建了瞬时敲低RPS3的细胞系，以观察RPS3对S. Tm感染的调控。结果显示，RPS3敲低后，S. Tm诱导的巨噬细胞ROS产生减少，沙门菌感染引起的线粒体数量减少也被抑制，提示RPS3在防御S. Tm感染中可能起重要作用。

为阐明RPS3在精氨酸增强宿主防御S. Tm感染中的功能，研究对RPS3的潜在结合位点、精氨酸代谢和沙门菌感染相关蛋白进行了交集分析。结果显示RPS3与丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3（SRSF3）存在相互作用。GENEMANIA分析结果表明，RPS3和SRSF3可能与线粒体凋亡通路中的关键蛋白存在相互作用，提示精氨酸可能通过影响RPS3和SRSF3的相互作用来抑制线粒体凋亡通路。随后在细胞水平验证了RPS3和SRSF3的相互作用，RAW264.7细胞系中的免疫共沉淀（Co-IP）实验证明，RPS3和SRSF3在细胞中存在生理性相互作用，并且这种相互作用可以被精氨酸有效阻断。结合已有研究指出SRSF3可通过结合BCL-2相互作用细胞死亡抑制因子（BIS）的前体mRNA来抑制凋亡，上述数据表明，在S. Tm感染期间，精氨酸通过调节RPS3和SRSF3的相互作用，扮演了稳定细胞状态的关键调节角色。

讨论

本研究揭示了大肠杆菌Nissle 1917（EcN）通过精氨酸介导的机制抑制鼠伤寒沙门菌（S. Tm）诱导的巨噬细胞凋亡，从而缓解肠道炎症的新机制。研究结果强调了精氨酸代谢在重塑“益生菌-病原体-宿主”三元关系中的关键作用，为EcN的治疗潜力提供了代谢视角的解读。

EcN能降低S. Tm对RAW264.7细胞的粘附和侵袭，但这种效应与精氨酸的细胞内积累无关，而可能与竞争性排斥、肠道屏障功能调节、先天免疫反应调控以及非精氨酸代谢产物的产生等其他机制相关。精氨酸积累不影响细菌的粘附-侵袭，但可能通过调节巨噬细胞损伤来影响入侵后的致病性，这对于理解效应阶段的机制和精氨酸在细菌致病性中的完整作用至关重要。精氨酸积累促进了巨噬细胞介导的胞外细菌清除，这可能与精氨酸代谢激活产生抗菌物质、调节免疫信号通路增强细胞因子分泌、重塑胞外环境抑制细菌增殖以及促进抗菌肽释放等机制相关。体内实验证明，EcN/精氨酸预处理能减少S. Tm的初始定植，这可能归因于免疫系统的动态重塑、肠道微环境中的多细胞网络以及肠道菌群群落的协同适应等多种途径的协同调控。

尽管其他益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌主要通过Toll样受体信号或短链脂肪酸调节免疫发挥作用，但EcN通过保护巨噬细胞免受膜损伤、染色质凝聚和DNA降解来抑制其凋亡。EcN的独特性在于其依赖精氨酸积累来调节宿主-病原体相互作用。这种代谢策略不仅补偿了S. Tm感染期间的精氨酸耗竭，还缓冲了炎症微环境。该机制与其他益生菌相比强调较少。本研究与Zhao等人的观点一致，即精氨酸脱亚胺酶途径是EcN相较于大肠杆菌BL21或MG1655的独特特征，证实了氨基酸代谢在EcN定植肠道和宿主防御中的进化适应性。

精氨酸在炎症中的作用具有双重性——它既可以是促炎的，也可以是抗炎的，这一直存在争议。本研究的数据支持其抗炎作用，证明精氨酸能抑制ROS、线粒体功能障碍和Caspase-3激活。这表明精氨酸的作用是环境依赖性的，可能取决于炎症微环境的pH值或氧化应激水平。精氨酸通过代谢重编程充当“代谢检查点”，与直接调节免疫因子相比，可能降低全身性免疫抑制的风险。结合相关研究，精氨酸代谢与色氨酸和谷氨酸代谢存在交叉相互作用，提示“氨基酸代谢网络失衡”可能是肠道炎症的一个共同特征，而EcN在重塑精氨酸代谢中扮演了核心调控角色。值得注意的是，S. Tm感染期间血清精氨酸的减少与在克罗恩病中的观察相似，提示精氨酸耗竭可能是肠道菌群失调的标志物之一。此外，外源性精氨酸干预巨噬细胞能以剂量依赖的方式减少细菌载量。这表明巨噬细胞采用了“精氨酸积累”策略来限制S. Tm的生长——在感染期间，S. Tm需要消耗宿主精氨酸以促进自身增殖（例如组装III型分泌系统），而EcN持续释放的精氨酸补偿了这一关键资源的缺乏。

进一步研究发现，精氨酸可能通过干扰核糖体蛋白S3（RPS3）与丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3（SRSF3）之间的相互作用来抑制线粒体凋亡通路。基于GeneMANIA的分析结果，RPS3作为核糖体蛋白，在凋亡中扮演非经典角色，这与其他核糖体蛋白（如RPS6）在炎症中的功能形成对比，提出了“核糖体蛋白辅助功能”的新视角。参考SRSF3与BIS mRNA结合机制的相关研究，推测精氨酸可能通过构象变化解除RPS3对SRSF3的隔离，从而释放SRSF3对BCL-2的调控。这也暗示在应对细菌攻击时，RPS3可能利用替代机制来保护细胞，例如直接参与核糖体应激反应或调节额外的信号分子。

在临床转化方面，本研究的发现具有显著的应用潜力，但也面临一些挑战。值得注意的是，精氨酸在肿瘤微环境中可以抑制免疫细胞功能并促进肿瘤发展，因此EcN在炎症与肿瘤共病患者中的适用性需要探讨，或可考虑与精氨酸酶抑制剂联合使用。此外，当前工作的一个关键局限性在于缺乏体内精氨酸浓度的验证。正如文中所强调，测量EcN给药前后血浆和肠道组织中的精氨酸水平对于将体外发现与体内相关性联系起来至关重要。此类数据将直接证实所给予的EcN剂量是否达到了与细胞实验中使用的有效精氨酸浓度相当的水平——这是验证观察到的体内表型确实由精氨酸升高介导的关键环节。此外，关于精氨酸是否通过降低RPS3与SRSF3之间的结合亲和力来发挥其调节作用，需要分子相互作用的直接证据支持。直接验证蛋白质-蛋白质相互作用对于解析分子调控通路至关重要。在该领域，微量热泳动（MST）和表面等离子共振（SPR）被认为是量化蛋白质-蛋白质相互作用的金标准技术。这些方法能够通过精确测量存在与不存在精氨酸条件下RPS3-SRSF3相互作用的解离常数（Kd），来直接验证结合亲和力的改变。将这些体外生化发现与细胞模型中的功能检测相结合，将有助于构建从分子机制到生物学功能的完整调控图谱，从而更全面地理解精氨酸在相关信号通路或细胞过程中的生理和病理意义。

尽管如此，本研究首次揭示了EcN在S. Tm感染时通过产生精氨酸抑制巨噬细胞凋亡的新机制，为肠道炎症的治疗提供了新的靶点和策略。未来的研究可聚焦于精氨酸代谢与其他氨基酸代谢的相互作用、RPS3与SRSF3相互作用的具体调控机制、精氨酸是否通过调节肠道菌群结构或影响调节性T细胞/Th17细胞平衡来重塑黏膜免疫微环境从而间接增强宿主防御能力等方面，进一步完善这一三元相互作用网络的机制图谱，以全面揭示肠道炎症的发病机理和治疗靶点。