TNF-α通过上调ADAM17介导哮喘肺泡巨噬细胞CD36下调及吞噬功能受损的机制研究

《Frontiers in Immunology》：TNF-α-mediated downregulation of CD36 and phagocytic impairment of alveolar macrophages via upregulation of ADAM17 in asthma

本研究揭示了在卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘模型中，气道肿瘤坏死因子-α（TNF-α）通过上调去整合素金属蛋白酶17（ADAM17）的表达，进而切割并下调肺泡巨噬细胞（AMs）表面的吞噬受体CD36，最终导致AMs对凋亡细胞的清除能力受损。该发现阐明了TNF-α-ADAM17-CD36信号轴在哮喘发病中的新机制，为靶向该通路以恢复AMs功能、治疗哮喘提供了潜在的新策略。

　　

1 Introduction

哮喘是一种影响全球约3亿人的慢性气道炎症性疾病，其临床特征包括咳嗽、喘息、呼吸急促和胸闷，与气道炎症、高反应性和重塑密切相关。哮喘可分为2型高（type 2-high）和2型低（type 2-low）两种内型。在2型高哮喘中，慢性气道炎症主要由Th2细胞和2型固有淋巴细胞驱动，由2型细胞因子（如白细胞介素-4 (IL-4)、IL-5和IL-13）介导，导致嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖和活化失调，以及上皮损伤和凋亡加剧。凋亡细胞在气道中的积聚及其清除受损进一步加剧了炎症反应。

吞噬作用是细胞摄取直径大于0.5微米颗粒的过程，是先天免疫的关键机制，使免疫系统能够清除病原体和凋亡细胞，从而预防感染和炎症。肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophages, AMs）是支气管肺泡区域的专职吞噬细胞，构成抵御肺部感染的第一道防线。它们通过吞噬入侵的细菌和病毒来清除病原体，并清除凋亡细胞，减轻炎症级联反应，促进组织修复，维持支气管肺泡稳态。

AMs的吞噬能力受到多种疾病和环境因素的动态调控。例如，在脂多糖诱导的肺损伤模型中，ADAM17（A Disintegrin And Metalloproteinase 17）表达降低显著增强了AMs对凋亡中性粒细胞的吞噬作用；而在急性肺炎克雷伯菌肺部感染中，CD36缺陷的AMs对病原体的吞噬清除能力明显降低。越来越多的证据表明，AMs在慢性阻塞性肺疾病中表现出显著受损的吞噬能力。此外，急性臭氧诱导的肺炎症通过MERTK受体缺陷损害了AMs对凋亡中性粒细胞的吞噬。然而，在哮喘发病过程中，AMs吞噬作用的特征和潜在机制仍不清楚。

本研究通过卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）致敏和激发构建了小鼠2型高哮喘模型，旨在探讨OVA诱导的哮喘小鼠中AMs吞噬能力的变化及其潜在机制。

2 Materials and methods

2.1 Animals

使用无特定病原体（Specific pathogen-free）的雌性BALB/c小鼠进行实验。

2.2 Construction of an asthma model

将九周龄雌性小鼠随机分为对照组（PBS处理）、OVA组、TNF-α抗体阻断组（TNF-Ab）和同型对照组（OVA + Iso Ab）。OVA组小鼠在第0、3、5天腹腔注射100 μg OVA和2 mg Al(OH)₃佐剂（溶于200 μL PBS）。对照组注射等体积PBS。在第10、12、14天，OVA组通过滴鼻给予50 μg OVA进行气道激发。对照组给予等体积PBS。在TNF-Ab组，每次气道激发前12小时，通过滴鼻给予300 μg/kg的TNF-α中和抗体。同型对照组（OVA + Iso Ab）按照相同方案给予等量的同型对照抗体。所有评估在最后一次激发后24小时进行。

2.3 Paraffin embedding and hematoxylin-eosin staining

肺组织经4%多聚甲醛（PFA）固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片（5 μm）进行苏木精-伊红（H&E）染色，光镜观察。

2.4 Detection of airway resistance

使用侵入性肺功能系统测量气道阻力（RL）。小鼠麻醉后气管插管并机械通气。雾化给予乙酰胆碱氯（0–30 mg/mL），通过测量呼吸系统阻力（Rrs）的变化评估气道高反应性。

2.5 Lung wet/dry weight ratio

计算左肺湿重与干重的比值（W/D），以评估肺水肿程度。

2.6 Enzyme-linked immunosorbent assay

使用商业ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-5、IL-1β和TNF-α的浓度。

2.7 Isolation of bronchoalveolar lavage fluid

处死小鼠后，用冰PBS进行支气管肺泡灌洗。收集BALF，离心，裂解红细胞，将细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。通过贴壁法（37°C，2小时）纯化AMs，并通过流式细胞术确认Siglec-F⁺/CD11c⁺细胞纯度大于95%。

2.8 Measurement of soluble CD36

使用ELISA检测BALF和AMs培养上清液中的可溶性CD36（sCD36）水平。

2.9 Eosinophil count

通过Wright染色对BALF细胞涂片进行染色，显微镜下计数嗜酸性粒细胞。

2.10 Induction of apoptotic cells

使用喜树碱（10 μM）诱导AEC或Jurkat细胞凋亡24小时，然后用Cell-Tracker Green CMFDA（5 μM）标记凋亡细胞。

2.11 Phagocytosis assay

将分离的AMs（1×10⁵细胞/孔）接种于24孔板，用Cell-Tracker Deep Red标记。加入CMFDA标记的凋亡细胞（3×10⁵个）共培养6小时。通过流式细胞术分析AMs的吞噬率（FITC通道阳性细胞百分比）。

2.12 Flow cytometry analysis of surface molecule expression on AMs

使用特异性抗体（抗CD36、抗MERTK、抗ADAM17）和同型对照抗体冰上孵育AMs 30分钟，固定后通过流式细胞术检测表面分子表达，以平均荧光强度（MFI）表示。

2.13 RNA extraction and qRT-PCR assays

提取AMs总RNA，逆转录为cDNA，使用LightCycler 480进行实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达。

2.14 The siRNA transfection

使用Lipofectamine 2000将ADAM17特异性小干扰RNA（siRNA）或非靶向对照siRNA转染至AMs。转染后48小时进行后续实验。

2.15 Western blotting

使用膜蛋白提取试剂盒提取AMs膜蛋白，BCA法测定浓度。等量蛋白经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，用抗ADAM17和一抗（Na⁺/K⁺-ATPase作为膜蛋白内参）孵育，HRP标记的二抗孵育后显影。

2.16 Statistical analysis

数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism 9进行统计分析。多组比较采用单因素（或双因素）方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。两组比较采用Student t检验。P值小于0.05认为有统计学意义。

3 Results

3.1 The phagocytic capacity of AMs is markedly reduced in OVA-induced mice

成功建立OVA诱导的哮喘小鼠模型。与对照组相比，OVA诱导小鼠表现出显著的气道炎症、气道阻力增加、BALF中总细胞数、嗜酸性粒细胞数以及促炎细胞因子（IL-1β、IL-4、IL-5）水平升高，证实模型为2型高内型。流式细胞术分析显示，与对照组相比，OVA诱导小鼠的AMs对凋亡AEC和凋亡胸腺细胞（Jurkat细胞）的吞噬能力显著受损。这些结果表明，在OVA诱导的哮喘小鼠中，AMs的吞噬能力明显降低。

3.2 The impaired phagocytic capacity of AMs from OVA-induced mice is associated with the downregulation of CD36 expression levels

巨噬细胞的吞噬作用由直接或间接结合磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）的受体介导。流式细胞术数据显示，与对照组相比，OVA诱导小鼠AMs表面的CD36（直接PS结合受体）表达水平显著下调。而间接PS结合受体MERTK的表达在两组间无显著差异。使用CD36阻断抗体处理AMs后，对照组和OVA诱导组AMs的吞噬能力均显著受损，证实了CD36在吞噬中的关键作用。这些发现表明，OVA诱导小鼠AMs吞噬能力受损可能主要归因于CD36表达减少。

3.3 ADAM17 negatively regulates the phagocytic capacity of AMs through downregulation of CD36 expression on the surface of AMs

为探究OVA诱导小鼠AMs CD36表达降低的原因，检测了BALF中可溶性CD36（sCD36）水平。发现OVA组sCD36水平显著高于对照组，提示CD36被切割并释放到体液中。ADAM17是一种膜结合金属蛋白酶，可通过切割细胞表面受体调节细胞吞噬能力。流式细胞术分析显示，与对照组相比，OVA诱导小鼠AMs表面ADAM17表达显著上调。

通过小干扰RNA（siRNA）敲低AMs中的ADAM17，敲低效率约70%。ADAM17敲低后，AMs表面CD36表达显著增加，同时培养上清中sCD36浓度显著降低。这些实验证明ADAM17介导了CD36的蛋白水解切割。进一步功能实验显示，ADAM17敲低显著增强了AMs的吞噬能力。这些结果表明，ADAM17通过下调AMs表面CD36表达来抑制吞噬作用。

3.4 TNF-α-mediated downregulation of CD36 on AMs via ADAM17 suppresses the phagocytic capacity of AMs.

ELISA检测显示，OVA诱导小鼠BALF中TNF-α水平显著高于野生型对照组。用不同浓度TNF-α（10-500 pg/ml）处理野生型小鼠AMs 24小时，发现TNF-α显著抑制AMs吞噬能力，其中200 pg/mL抑制作用最明显。200 pg/mL TNF-α处理AMs 24小时后，其表面ADAM17表达上调，CD36表达下调，而上清中sCD36水平升高。

在体实验中，对OVA诱导小鼠进行TNF-α阻断后，其AMs表面ADAM17表达下调，CD36表达上调，BALF中sCD36水平降低，同时AMs吞噬能力显著增强。

为阐明TNF-α调控AMs吞噬的机制，在体外敲低AMs的ADAM17后，再给予TNF-α刺激。结果显示，与单纯TNF-α刺激加对照siRNA（TNF-α+si-NC）组相比，TNF-α刺激加ADAM17-siRNA（TNF-α+si-ADAM17）组AMs表面CD36表达显著上调，上清sCD36含量降低，吞噬能力显著增强。这表明敲低ADAM17可减轻TNF-α诱导的CD36表达下调和吞噬功能抑制。

综上所述，TNF-α通过上调ADAM17来减少CD36表面表达，从而损害AMs的吞噬功能。

4 Discussion

本研究显示，OVA诱导哮喘小鼠的AMs吞噬能力显著受损。AMs的吞噬作用由对凋亡标志物（如PS）的特异性识别及其吞噬受体介导。CD36作为B类清道夫受体，对PS的直接识别至关重要。本研究首次在OVA诱导的2型高哮喘模型中证明AMs表面CD36表达显著下调，并通过CD36阻断实验确立了CD36功能丧失与AMs吞噬能力受损之间的因果关系。有趣的是，间接PS结合受体MERTK在OVA诱导的AMs中未发生显著变化，其功能值得进一步研究。

ADAM家族成员在调节吞噬细胞表型中起重要作用，其功能因病理微环境而异。本研究发现OVA诱导小鼠AMs表面ADAM17表达升高。ADAM17具有广泛的底物受体，包括多个调控吞噬功能的关键受体，如CD36。我们发现哮喘小鼠AMs表面CD36受体表达下调，且与ADAM17表达呈负相关。ADAM17敲低实验证明，ADAM17负调控CD36表达。敲低ADAM17后，CD36表面表达水平和AMs吞噬能力均显著恢复，表明ADAM17通过蛋白水解切割下调CD36受体表达。因此，CD36是ADAM17在OVA诱导哮喘模型中调控AMs吞噬功能的关键介质。

TNF-α是哮喘气道炎症的核心介质，本研究中其在OVA诱导小鼠BALF中的水平显著升高。本研究结果与先前研究一致，即TNF-α以剂量依赖的方式抑制AMs的吞噬能力，且在体TNF-α阻断后AMs吞噬能力部分恢复。这些发现表明TNF-α介导的炎症导致了OVA诱导小鼠AMs吞噬能力受损。

我们发现TNF-α上调AMs中ADAM17表达，同时下调CD36表达。在体TNF-α阻断导致AMs表面ADAM17表达降低，伴随CD36表达水平升高。体外ADAM17敲低实验揭示，TNF-α通过ADAM17下调CD36表达，从而调节AMs的吞噬能力。这些结果强调了TNF-α–ADAM17–CD36轴在2型高哮喘肺泡巨噬细胞吞噬活性中的关键作用，为了解该哮喘亚型的免疫调节机制提供了新见解。ADAM17作为TNF-α的关键下游效应分子，通过下调吞噬受体CD36的表达损害AMs的吞噬功能，从而参与OVA诱导哮喘模型的发病机制。这一发现支持了针对TNF-α信号通路（如TNF-α拮抗剂）或ADAM17活性（如特异性抑制剂）的治疗策略的开发，可能恢复CD36依赖性吞噬作用，为哮喘治疗提供新途径。

总之，本研究证明在OVA诱导的小鼠气道中，TNF-α上调ADAM17表达，并降低AMs表面CD36表达，从而损害AMs对凋亡细胞的吞噬作用。通过聚焦2型高哮喘亚型、阐明CD36的独特调控机制、建立全面的体外和体内验证框架，本研究为靶向哮喘治疗中吞噬相关机制提供了系统证据，有助于进一步探索哮喘发病的分子机制和识别新的治疗靶点。