紫檀芪通过激活STING通路增强抗肿瘤免疫抑制非小细胞肺癌进展

《Frontiers in Immunology》：Pterostilbene inhibits non-small cell lung cancer progression by activating the STING pathway and enhancing antitumor immune response

本研究揭示了天然化合物紫檀芪（PTE）通过诱导活性氧（ROS）介导的DNA损伤，激活STING/TBK1/IRF3信号通路，促进CD8+ T细胞浸润与功能活化（TNF-α+、Granzyme B+、IFN-γ+），同时抑制髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs），在非小细胞肺癌（NSCLC）中实现直接杀伤肿瘤细胞与重塑免疫微环境的双重抗肿瘤机制。

　　

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）占病例大多数，常诊断于晚期，治疗选择有限且预后不良。当前治疗策略包括手术切除、放疗、化疗、分子靶向药物和免疫治疗，但总体生存获益仍不理想。免疫检查点抑制剂（ICIs）虽已革新肿瘤治疗，但耐药常见。天然产物和传统中药是生物活性化合物的丰富来源。紫檀芪（PTE）是传统药用植物紫檀（Pterocarpus marsupium）心材中的一种茋类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性。然而，PTE在NSCLC中的作用机制，特别是涉及先天免疫激活和肿瘤微环境（TME）重塑的机制，尚未完全阐明。本研究旨在探讨PTE对NSCLC细胞存活、分裂和凋亡的影响，及其通过激活STING/TBK1/IRF3通路调节免疫反应的潜力。

材料与方法

研究使用纯度≥98%的药用级PTE。通过CCK-8法评估PTE对A549和H358 NSCLC细胞系活力的影响。采用Annexin V/PI染色和流式细胞术分析细胞凋亡，PI染色分析细胞周期。通过Transwell实验评估细胞侵袭，Western blot分析关键蛋白表达，DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）水平。使用STING抑制剂H-151和shRNA敲低STING验证通路作用。在H358异种移植模型和免疫健全的LLC1小鼠模型中评估PTE的体内疗效及其对肿瘤免疫微环境的影响，通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞。

结果

PTE显著抑制NSCLC细胞活力

PTE以浓度和时间依赖性方式显著抑制A549和H358细胞的活力。计算出的半数抑制浓度（IC₅₀）值显示两种细胞系对PTE的敏感性不同。基于此，选择10、20、30和40 μM浓度进行24小时处理作为后续实验条件。

PTE有效抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭

集落形成实验显示，PTE处理14天可浓度依赖性显著减少A549和H358细胞的集落数量，效果与顺铂（6.67 μM）相当。Transwell侵袭实验进一步证明PTE以剂量依赖性方式抑制细胞侵袭。这些发现表明PTE抑制了NSCLC细胞的增殖能力和侵袭行为。

PTE诱导NSCLC细胞凋亡

Annexin V/PI染色和流式细胞术显示，PTE处理以浓度依赖性方式诱导A549和H358细胞凋亡。细胞周期分析显示PTE处理导致G2/M期阻滞。这些数据表明PTE促进了NSCLC细胞的凋亡性细胞死亡并破坏了细胞周期进程。

PTE诱导NSCLC细胞ROS产生

活性氧是凋亡的关键介质。流式细胞术分析显示，PTE处理后，A549和H358 NSCLC细胞中ROS水平显著增加。免疫荧光数据支持这些发现。为研究ROS与PTE诱导的生长抑制之间的关系，使用ROS清除剂NAC进行实验。CCK8实验证明，NAC预处理有效逆转了PTE对A549和H358细胞增殖的抑制作用。此外，NAC预处理显著减少了PTE诱导的凋亡。这些发现表明ROS在PTE诱导的NSCLC细胞死亡和增殖抑制中起关键作用。为阐明ROS与STING激活的关系，进行额外实验。Western blot分析显示，NAC预处理显著抑制了PTE诱导的STING、TBK1和IRF3磷酸化。此外，NAC消除了PTE诱导的CXCL10和CCL5 mRNA上调。这些结果证实ROS生成先于并是STING通路激活和后续趋化因子产生所必需的。

PTE显著激活NSCLC细胞中的STING通路

为确定STING信号是否有助于PTE的抗肿瘤作用，检测PTE处理后A549和H358细胞中的通路激活。PTE处理显著增加了STING、TBK1和IRF3的磷酸化，表明通路激活。STING激活通常由胞质双链DNA（dsDNA）触发，常源于基因组应激或DNA损伤。因此，通过测量γ-H2AX表达评估DNA损伤反应。PTE处理后，两种细胞系中均检测到γ-H2AX水平升高，证实诱导了DNA损伤。为深入研究STING在PTE诱导效应中的功能作用，使用选择性STING抑制剂H-151。H-151预处理显著抑制PTE诱导的TBK1和IRF3磷酸化，并部分恢复细胞增殖和活力，支持STING在PTE介导的抗癌活性中的功能参与。为补充药理学抑制方法并排除H-151的脱靶效应，在A549和H358细胞中进行shRNA介导的STING敲低。Western blot分析证实两种细胞系中STING蛋白表达成功降低，qPCR验证了STING mRNA的下调。与H-151结果一致，STING敲低显著逆转了PTE诱导的细胞活力抑制，并减少了PTE诱导的凋亡。这些来自药理学和遗传学方法的收敛性发现强有力地证实STING激活对PTE的抗肿瘤效应至关重要。

PTE抑制H358肿瘤异种移植生长

为评估PTE的体内抗癌功效，建立异种移植模型。在整个实验期间，PTE治疗组和对照组之间体重无显著差异，表明PTE在给药剂量下未诱导系统性毒性。值得注意的是，PTE治疗显著抑制了肿瘤生长与载体对照相比。从治疗后第14天起，肿瘤体积出现统计学显著减少。终点时，PTE治疗组切除的肿瘤肉眼可见更小，且重量显著低于对照组。这些体积和重量测量的一致结果稳健地证明了PTE在体内对NSCLC肿瘤进展的抑制作用。

PTE通过增加CD8⁺ T细胞抑制小鼠NSCLC模型中的肿瘤生长

肿瘤细胞中STING通路的激活可启动针对肿瘤的强效先天性和适应性免疫反应。为研究PTE是否通过免疫调节发挥抗癌作用，使用免疫健全的NSCLC小鼠模型。PTE治疗未引起NSCLC小鼠显著体重减轻。从治疗第15天起，观察到PTE治疗组肿瘤抑制的显著趋势，伴随肿瘤体积和总体肿瘤重量的显著减少。为阐明所涉及的免疫机制，首先测量关键抗肿瘤细胞因子的系统水平。在实验终点（第24天），小鼠血浆的ELISA分析显示PTE治疗显著提高了IFN-γ和TNF-α的浓度，表明Th1型免疫反应的激活。为获得更深入的见解，使用流式细胞术评估TME内的抗肿瘤免疫活性。分析显示，与接受载体溶液的对照组相比，PTE治疗组中CD8⁺ T细胞的活性和丰度均增加。值得注意的是，PTE治疗小鼠肿瘤中的CD8⁺ T细胞表现出更强大的激活特征，与对照组相比，产生显著更高水平的TNF-α、GrzmB和IFN-γ。此外，观察到PTE治疗小鼠肿瘤中MDSCs、Tregs和TAMs群体减少。这一发现表明PTE不仅增强了抗肿瘤CD8⁺ T细胞的激活，还减轻了TME中的免疫抑制环境。

讨论

本研究证明PTE通过涉及直接ROS介导的细胞毒性和STING依赖性免疫激活的双重机制有效抑制NSCLC进展。关键发现包括：PTE诱导ROS依赖性DNA损伤、细胞周期阻滞和凋亡；PTE以ROS依赖性方式激活STING/TBK1/IRF3通路；STING的遗传和药理学抑制减弱PTE效应，确立其必要性；PTE在异种移植模型中抑制肿瘤生长；在免疫健全模型中，PTE增强CD8⁺ T细胞浸润和功能，同时减少免疫抑制群体。

肺癌仍是全球最普遍的恶性肿瘤和癌症相关死亡的主要原因。尽管晚期NSCLC的治疗方案已扩展至化疗、靶向治疗、免疫治疗、放疗和联合治疗，但严重副作用和疗效有限等重大挑战持续存在，尤其是在经常产生耐药性的KRAS突变患者中。因此，迫切需要新的治疗剂，来自传统医学的天然化合物因其在癌症治疗中的潜力而日益受到关注。

PTE是白藜芦醇的天然甲基化类似物，具有一系列有益特性，包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。虽然先前研究报道了其在各种恶性肿瘤中的抗癌作用，但PTE在NSCLC中的具体抗癌机制很大程度上尚未探索。有趣的是，我们的发现揭示PTE以浓度依赖性方式抑制NSCLC细胞增殖，并在A549和H358细胞系中破坏G2期细胞周期。与许多通过ROS积累和线粒体破坏运作的常规化疗药物类似，PTE似乎主要通过ROS产生介导其抗癌效应。ROS的适度增加可通过诱导DNA损伤抑制肿瘤进展，而过量ROS导致氧化应激，引起增殖受损和细胞死亡。因此，ROS水平的药理学调控代表了一种有前景的选择性抗癌治疗策略。我们的结果确定ROS诱导是PTE诱导NSCLC细胞死亡的关键机制，伴随ROS水平升高。

STING通路的激活已成为一种有前景的免疫治疗策略。我们发现PTE在NSCLC细胞中激活STING信号，可能通过诱导DNA损伤和增加胞质dsDNA实现。这种机制与报道一致，即PARP抑制剂、CHK1抑制剂以及常规化疗药物如顺铂和吉西他滨可通过各种癌症中胞质dsDNA积累激活STING。我们的数据表明PTE诱导DNA损伤并增加胞质dsDNA，可能启动NSCLC中的STING激活。

TME在NSCLC治疗反应中起关键作用。尽管CD8⁺ T细胞对抗肿瘤免疫至关重要，但NSCLC TME表现出阻碍T细胞功能的免疫抑制特性。因此，增强抗肿瘤免疫的策略通常侧重于对抗免疫抑制元素，例如通过靶向Tregs或MDSCs。我们的结果表明PTE通过促进CD8⁺ T细胞浸润和减少免疫抑制细胞群体有利地调节TME。

联合疗法的开发代表了改善癌症免疫治疗结果的关键方向。基于我们的机制发现——PTE诱导免疫原性细胞死亡并激活STING通路——我们假设PTE可能与靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂协同作用。我们推测PTE可通过趋化因子诱导招募T细胞来启动TME， potentially使抗PD-1/PD-L1药物更有效地逆转T细胞耗竭。这种组合值得进一步探索，作为克服免疫学"冷"肿瘤（T细胞浸润极少）中耐药性的潜在策略。

ROS在PTE诱导凋亡中的关键作用通过NAC减弱此效应得到证实。在体内，PTE给药减少了H358异种移植模型中的肿瘤重量和体积，并在免疫健全NSCLC模型中显著抑制肿瘤生长，与肿瘤内CD8⁺ T细胞积累增加相关。总之，这些结果阐明了PTE通过ROS诱导和STING通路激活抑制NSCLC生长的新机制。

药代动力学特性与转化潜力

在确立PTE抗肿瘤功效的机制基础后，考虑了其转化潜力。先前报告表明，PTE具有优于白藜芦醇的药代动力学特征，归因于其甲氧基，增强了口服生物利用度和代谢稳定性。动物研究表明，PTE口服后15-30分钟内达到血浆峰值浓度，并可检测长达8小时，分布于包括肺、肝和肾的组织中。我们体内研究中使用的剂量（10 mg/kg，腹腔注射）产生的血浆浓度与我们体外模型中的有效浓度一致，支持我们发现的生物学相关性。PTE在临床前研究中表现出良好的安全性，在有效剂量下未观察到显著毒性。在我们的实验中，未观察到显著体重减轻或行为改变，表明有限的系统毒性。我们承认详细的PK/PD研究超出了这项初始机制工作的范围。未来研究应侧重于表征免疫健全NSCLC模型中PTE的药代动力学、生物分布和最大耐受剂量，以更好地弥合我们的发现与临床应用之间的差距。纳米制剂策略，如自组装胶束，可以进一步改善肿瘤特异性递送并最小化脱靶效应。

治疗窗口与免疫疗法联合潜力

我们提出的10 mg/kg剂量基于先前证明有效且无过度毒性的研究。为了将PTE置于当前NSCLC治疗背景中，讨论了其克服免疫检查点抑制剂（ICIs）局限性的潜力。ICIs在"免疫冷"肿瘤中显示有限疗效， due to poor T-cell infiltration and immunosuppressive microenvironments。我们的数据表明PTE通过激活STING介导的信号重塑肿瘤微环境（TME），导致趋化因子产生增加（如CXCL10, CCL5）并增强CD8⁺ T细胞招募和功能。这种机制与最近旨在将"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤的策略一致。我们提出PTE可能与ICIs协同通过启动TME——首先通过ROS/STING诱导免疫原性细胞死亡和先天免疫激活，随后ICI介导的T细胞耗竭逆转。这种顺序可能潜在地扩大治疗窗口并解决ICI耐药性。未来工作将直接评估PTE与抗PD-1抗体在免疫健全NSCLC模型中联合使用的疗效。

局限性与未来展望

尽管有 promising 发现，本研究有几个局限性需要承认。首先，使用的体内模型——包括免疫缺陷小鼠中的H358异种移植和免疫健全小鼠中的LLC1模型——可能不能完全 recapitulate 人类NSCLC的异质性和免疫抑制复杂性。LLC1模型尤其已知相对免疫原性，可能导致高估PTE的免疫调节功效。未来研究应使用基因工程小鼠模型（GEMMs），更好地模拟人类NSCLC关键分子亚型（如KRAS驱动或KRAS/p53突变模型），以在更临床相关环境中验证我们的发现。其次，虽然我们建立了ROS与STING激活之间的关键联系，但精确的机制步骤，如ROS是否主要引起线粒体DNA释放或使STING通路对现有胞质DNA敏感，仍有待阐明。第三，STING激活、趋化因子产生和抗肿瘤免疫之间的因果关系将通过功能验证实验加强，如体内CD8⁺ T细胞耗竭或中和关键趋化因子如CXCL10和CCL5。

为弥合机制洞察与临床应用之间的差距，概述以下未来研究方向：进行PTE在免疫健全NSCLC模型中的详细PK/PD和毒性研究，评估先进制剂以增强肿瘤靶向并最小化脱靶效应，最终在非人灵长类动物中进行毒性评估对于降低临床转化风险非常宝贵。系统评估PTE与标准护理免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1抗体）在一系列免疫健全模型中的协同潜力，旨在验证我们的假设，即PTE可以将"免疫冷"肿瘤转化为"免疫热"微环境，从而克服ICI耐药的主要机制。识别预测性生物标志物（如肿瘤STING通路激活状态、基线CD8⁺ T细胞浸润或趋化因子谱），以帮助识别最可能从PTE基础疗法中受益的患者亚组。

结论

我们的研究证明PTE通过涉及ROS介导的细胞毒性和STING依赖性免疫激活的双重机制有效抑制NSCLC进展。PTE在异种移植和免疫健全模型中显著抑制肿瘤生长，与增强CD8⁺ T细胞浸润和效应功能相关。这些发现提名PTE作为NSCLC治疗的有前景的治疗剂或辅助剂，特别是与免疫检查点抑制剂联合使用。后续研究将直接探究PTE与抗PD-1抗体在免疫健全模型中联合使用的疗效，以验证这种治疗策略。