综述：超越CAR-T细胞：探索实体瘤免疫治疗中的CAR-NK、CAR-M和CAR-γδ T策略

《Frontiers in Immunology》：Beyond CAR-T Cells: exploring CAR-NK, CAR-M, and CAR-γδ T strategies in solid tumor immunotherapy

本综述系统探讨了CAR-T细胞在实体瘤治疗中的局限性与新兴替代策略。文章聚焦CAR-NK、CAR-M及CAR-γδ T细胞的独特优势：CAR-NK具备MHC非依赖性杀伤、低毒性及“现货型”潜力；CAR-M擅长吞噬清除、抗原提呈及肿瘤微环境（TME）重塑；CAR-γδ T则结合CAR靶向性与固有应激信号识别能力。通过剖析细胞来源、CAR结构优化、作用机制及临床进展，为实体瘤免疫治疗提供多维度创新方案。

　　

引言

癌症是全球主要死亡原因之一。传统治疗方式如手术、放疗和化疗是早中期癌症的基石疗法，但其严重不良反应促使免疫治疗成为有前景的替代方案。嵌合抗原受体（CAR）工程化的过继性细胞治疗（ACT）是癌症免疫治疗的一项变革性进展。CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中显示出显著的临床成功，但其在实体瘤中的应用面临持续挑战，包括肿瘤特异性抗原缺乏、瘤内浸润差、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以及细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等治疗相关毒性。

免疫细胞

先天免疫是首要防线，包含髓系细胞和淋巴样细胞亚群。适应性免疫系统通过T细胞和B细胞特异性靶向并清除癌细胞。CAR-T疗法涉及对自体T淋巴细胞进行基因修饰，以表达具有肿瘤抗原识别胞外域和模拟T细胞受体（TCR）激活通路的胞内信号域的工程化受体。尽管CAR-T疗法在血液癌中取得显著成功，但其在实体瘤中的疗效仍受限于TME的免疫抑制异质性、抗原丢失或下调以及工程化T细胞向肿瘤部位运输和浸润不足。

CAR结构

CAR是合成受体，包含用于抗原识别的胞外单链可变片段（scFv）、用于结构稳定性的铰链区和跨膜结构域，以及用于细胞激活的胞内信号域（如CD3ζ）。第二代及以后的CAR加入了共刺激域（如CD28, 4-1BB）以增强效力和持久性。大多数CAR-NK研究采用了与CAR-T研究相似的CAR构建体，但引入了NK特异性信号域，如2B4、DAP10或DAP12。类似地，CAR-M研究也采用了CAR-T或CAR-NK的构建体，并加入了巨噬细胞特异性信号域，如Toll/IL-1R（TIR）域，其可促进巨噬细胞向M1表型极化。

超越CAR-T：新一代CAR工程化细胞疗法

CAR-NK细胞：先天识别与安全性

细胞来源

NK细胞来源于骨髓中的CD34⁺造血祖细胞（HPCs）。CAR-NK细胞的来源多样，包括原代细胞（外周血PB、脐带血UCB）、永生化细胞系（如NK92）和干细胞祖细胞（如诱导多能干细胞iPSCs）。iPSC来源的CAR-NK提供了可再生、均一且可扩展的“现货型”治疗产品潜力。

CAR-NK细胞的治疗机制

NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶介导细胞毒性。其活性由激活性和抑制性受体（如NKG2D、DNAM-1、NCRs、KIRs）的平衡调节。CAR-NK细胞不仅通过CAR介导特异性靶向，还通过CD16介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC），并通过分泌干扰素-γ（IFN-γ）招募巨噬细胞和树突状细胞（DCs），重塑TME。

CAR-NK细胞临床应用的挑战

原代CAR-NK细胞的体外扩增

实现原代CAR-NK群体的稳健体外扩增是关键障碍。基于饲养细胞（如K562）的扩增策略存在污染风险，而无饲养细胞方案（如细胞因子驱动）正在开发以提高安全性和可扩展性。脐带血来源的CD34⁺ HPCs和iPSCs的分化协议为生成高纯度NK细胞提供了可行路径。

CAR转导进入NK细胞

确保CAR的稳健、持久表达至关重要。病毒方法（慢病毒、逆转录病毒）可实现稳定整合，但存在插入突变风险。非病毒策略（如睡美人转座子系统、mRNA电穿孔）优先考虑安全性和可扩展性。CRISPR/Cas9等基因编辑工具可实现精确的基因组修饰，以增强功能。

CAR-M：吞噬作用与TME重塑

细胞来源

巨噬细胞由骨髓中的造血干细胞衍生而来。CAR-M可来源于健康供者的外周血、iPSCs、成纤维细胞以及细胞系（如THP-1）。iPSC衍生的CAR-M提供了一个工程友好且可扩展的平台。

CAR-M细胞的治疗机制

巨噬细胞具有显著可塑性，主要表现为M1（促炎、抗肿瘤）或M2（免疫抑制、促肿瘤）激活状态。CAR-M通过其CAR靶向肿瘤相关抗原（TAAs），直接吞噬肿瘤细胞。此外，它们分泌促炎细胞因子（如TNF-α, IL-6），将TAMs复极为M1表型，增强抗原呈递以激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），并降解细胞外基质（ECM）以改善免疫细胞浸润。

克服CAR-M生物工程局限性的策略

提高基因递送效率是关键。慢病毒载体（如掺入Vpx蛋白）或嵌合腺病毒载体（如Ad5f35）可有效转导巨噬细胞。非病毒平台，如脂质纳米颗粒（LNPs）递送CAR mRNA，显示出前景。工程化CAR-M共表达免疫刺激因子（如IL-12）可进一步增强其抗肿瘤功能。

γδ T细胞在肿瘤学中的治疗应用

细胞来源和体外扩增

γδ T细胞是连接先天和适应性免疫的淋巴细胞。主要来源是外周血单核细胞（PBMCs）。Vγ9Vδ2亚群可通过氨基二磷酸酸盐（如唑来膦酸）和细胞因子（如IL-2, IL-15）刺激进行大规模扩增。

CAR-γδ T细胞的治疗机制

CAR-γδ T细胞提供双重识别机制：CAR介导的特定TAA识别和通过固有γδ TCR及NKG2D等受体对应激诱导配体的先天识别。这降低抗原逃逸风险。

克服CAR-γδ T细胞生物工程局限性的策略

基因修饰可通过病毒载体或非病毒系统（如睡美人转座子）实现。通过选择共刺激域、共表达细胞因子（如IL-15）或敲除抑制性受体来增强持久性和功能是重要策略。

细胞疗法的临床试验

CAR-NK临床试验针对实体瘤抗原如NKG2D配体、间皮素（MSLN）、HER2和MUC1进行探索。CAR-M的早期试验（如NCT04660929）正在评估靶向HER2的CAR-M（CT-0508）的安全性。γδ T细胞疗法的临床试验已从使用未修饰细胞发展到评估工程化产品，显示出良好的安全性。

CAR-NK和CAR-M在妇科肿瘤中的应用

在卵巢癌（OC）等妇科肿瘤的临床前研究中，靶向ROBO1、CD44v6、MSLN、αFR、CD133、HER2等的CAR-NK和CAR-M显示出抗肿瘤效果。例如，靶向HER2/CD47的CAR-M可选择性吞噬OC细胞并激活CTLs。双靶向策略（如同时靶向HPV16 E7和TROP2）显示出协同作用。

展望

CAR-NK和CAR-M疗法为克服CAR-T在实体瘤中的局限性提供了有前景的替代方案。未来方向包括靶点创新、TME重编程、联合治疗方案以及CAR结构优化（如缺氧敏感CAR、逻辑门控CAR）。克服肿瘤浸润不足、免疫抑制性TME、抗原异质性/逃逸以及体内持久性差等障碍，对于充分释放这些新平台的临床潜力至关重要。开发标准化、具有成本效益的“现货型”产品是未来的关键目标。