基于脑脊液蛋白质组学解析儿童结核性脑膜炎的病理生理特征与生物标志物发现

本研究通过非靶向蛋白质组学技术（DIA-MS）对儿童结核性脑膜炎（TBM）患者脑脊液（CSF）进行深度分析，揭示了TBM相较于其他中枢神经系统（CNS）感染（如化脓性脑膜炎PM、病毒性脑膜炎VM、隐球菌性脑膜炎CCM）在补体激活、纤维蛋白凝块形成及胶原降解等通路的特异性改变。研究筛选出多组具有高诊断效能（AUC > 0.87）的蛋白组合（如F2/TYMP、ENPP2/WARS1等），为TBM的早期鉴别诊断及宿主导向治疗（HDT）提供了新的潜在靶点。

　　

1 引言

结核性脑膜炎（Tubercular Meningitis, TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的最严重结核病表现形式，在幼儿群体中发病率最高，死亡率接近20%，超过50%的幸存者会遗留严重神经系统后遗症。早期诊断困难重重，因其非特异性症状易与化脓性脑膜炎（Purulent Meningitis, PM）、病毒性脑膜炎（Viral Meningitis, VM）及新型隐球菌性脑膜炎（Cryptococcus neoformans Meningitis, CCM）混淆。传统诊断方法如抗酸染色灵敏度低，结核菌培养耗时漫长。新兴技术如XpertUltra和宏基因组下一代测序（Metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS）虽提升了灵敏度，但仍存在特异性不足或假阳性问题。因此，开发适用于儿童的TBM新型诊断工具迫在眉睫。既往蛋白质组学研究多聚焦于成人患者，而儿童TBM发病率更高，其脑脊液蛋白质组特征亟待阐明。

2 材料与方法

2.1 伦理批准与患者队列

本研究经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会批准。研究回顾性分析了104例住院患者的存档脑脊液样本，包括7例TBM、28例PM、20例VM、9例CCM、10例非感染性脑部疾病（Brain Disease, BD）患者及30例非中枢神经系统感染对照（Ctrl）。所有患者HIV检测均为阴性。

2.2 样本制备与蛋白质组学分析

脑脊液样本经过滤、离心后，采用滤膜辅助样本制备（Filter-Aided Sample Preparation, FASP）方法进行酶解。肽段通过超高效液相色谱（UltiMate 3000）耦合Exploris 480 Orbitrap质谱仪进行分析，采用数据非依赖采集（Data-Independent Acquisition, DIA）模式。原始数据使用Spectronaut Pulsar（v18.6）进行定量分析，数据库为SwissProt人类数据库。

2.3 数据分析与生物信息学

蛋白质组数据预处理包括缺失值插补（SeqKNN方法）和归一化。差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs）的定义标准为：与对照组相比，倍数变化（Fold Change, FC）≥2或≤0.5，且经Benjamini-Hochberg（BH）校正后的p值<0.05。功能富集分析使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件。采用多层次筛选策略（包括Spearman相关性分析、随机森林算法、ROC分析和置换检验）构建并评估用于区分TBM与其他组别的生物标志物组合。

3 结果

3.1 研究设计与蛋白质组概览

DIA-MS共鉴定到2781个蛋白质。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示，脑膜炎患者与对照组之间存在明显分离趋势。TBM与PM（r = 0.76）、CCM（r = 0.68）的蛋白质组变化模式相似度高于与VM（r = 0.60）的相似度。

3.2 TBM特征性通路改变

与对照组相比，TBM患者中鉴定出512个DEPs。IPA通路分析揭示，TBM最显著上调的通路包括补体级联反应（Z score = 5.90）、纤维蛋白凝块形成（Z score = 3.00）和微自噬信号。同时，胶原降解过程呈现显著抑制。蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析显示，胶原蛋白COL1A1、COL1A2、COL6A1等是关键的枢纽蛋白，并与基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase 2, MMP2）、血管细胞粘附蛋白1（Vascular Cell Adhesion Protein 1, VCAM-1）等相互作用。研究推测，补体激活（如CFI、CFH、C8A、C8B等关键分子上调）与凝血异常共同参与TBM的病理过程，而胶原蛋白下调可能通过影响细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）组织和神经突向外生长（Neurite Outgrowth）信号（如NCAM信号通路），与神经系统后遗症相关。

3.3 细胞因子与受体分析

在检测到的310种细胞因子及其受体中，TBM患者有120种出现显著失调，其中91种（75.8%）为上调。41种失调细胞因子影响多种免疫细胞功能。值得注意的是，α-2-巨球蛋白（Alpha-2-Macroglobulin, A2M）和腺苷脱氨酶2（Adenosine Deaminase 2, ADA2）在TBM中的上调水平高于PM、VM和CCM，而血小板衍生生长因子B（Platelet-Derived Growth Factor Subunit B, PDGFB）则呈现最低表达水平。

3.4 生物标志物组合的构建与评估

通过严格的筛选流程，研究构建了多组具有高鉴别诊断效能的生物标志物组合：

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  TBM vs PM： 凝血因子II（Coagulation Factor II, F2）和胸苷磷酸化酶（Thymidine Phosphorylase, TYMP）组合，曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）为0.874（95% CI, 0.748-0.999）。
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  TBM vs VM： 外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2（Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 2, ENPP2）和色氨酰-tRNA合成酶（Tryptophanyl-tRNA Synthetase, WARS1）组合，AUC为0.929（95% CI, 0.827-1）。
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  TBM vs CCM： 凝血因子XII（Coagulation Factor XII, F12）、载脂蛋白M（Apolipoprotein M, APOM）和CD163分子（CD163 Molecule, CD163）组合，AUC高达0.993（95% CI, 0.869-1）。
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  TBM vs Ctrl（诊断模型）： 人类白细胞抗原B（Human Leukocyte Antigen B, HLA-B）和N-乙酰葡糖胺基转移酶1（Mannosyl (Alpha-1,3-)-Glycoprotein Beta-1,2-N-Acetylglucosaminyltransferase, MGAT1）组合，AUC为0.934（95% CI, 0.825-1）。
  事后效能分析（Post-hoc Power Analysis）表明，大多数生物标志物在当前样本量下具有较好的区分能力。

4 讨论

本研究首次系统描绘了儿童TBM的脑脊液蛋白质组图谱。研究发现TBM的病理生理特征与补体系统过度激活和凝血功能障碍密切相关，提示针对补体成分（如CFI、C8）或抗凝治疗可能成为未来的宿主导向治疗（Host-Directed Therapy, HDT）策略。胶原蛋白（尤其是COL6A1）的显著下调可能影响ECM稳态和神经修复，其机制值得深入探索。

筛选出的生物标志物组合显示出优异的鉴别诊断潜力。其中，F2参与凝血，ENPP2在神经损伤后的反应性星形胶质细胞中高表达，APOM曾被报道为儿科细菌性脑膜炎的潜在标志物，MGAT1在胶质母细胞瘤中高表达。这些蛋白与脑部疾病病理的相关性间接支持了其作为TBM生物标志物的合理性。

细胞因子谱分析进一步揭示了TBM独特的炎症环境。A2M和ADA2在TBM中的特异性高表达，使其成为潜在的HDT靶点。A2M可结合多种细胞因子（如PDGF），ADA是成人TBM鉴别诊断的常用指标，本研究提示其同工酶ADA2在儿童TBM中也可能具有重要价值。

研究的局限性包括样本量较小、单中心回顾性设计以及结论基于关联性分析。未来需要通过靶向质谱（如平行反应监测，Parallel Reaction Monitoring, PRM）和免疫学方法（如ELISA）在更大规模、多中心队列中进行验证，并开展机制研究以确认候选分子的因果作用。

5 结论

本研究通过高通量蛋白质组学揭示了儿童结核性脑膜炎独特的脑脊液蛋白质组特征，突出了补体激活、凝血异常和细胞外基质重塑在疾病发生发展中的重要作用。所鉴定的特异性生物标志物组合为儿童TBM的早期精准鉴别诊断提供了新工具，而A2M、ADA2等关键分子则为开发宿主导向疗法提供了潜在靶点，对改善儿童TBM的预后具有重要科学意义和临床转化价值。