MAGLUMI化学发光法快速检测高尔基体蛋白73及其在慢性肝病患者肝纤维化/肝硬化中的临床价值

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Rapid detection of Golgi protein 73 by MAGLUMI chemiluminescent immunoassay and the clinical value to liver fibrosis/cirrhosis patients with chronic liver disease

本研究通过MAGLUMI化学发光免疫分析法（CLIA）检测高尔基体蛋白73（GP73），证实其与肝纤维化分期（METAVIR）及肝脏硬度测量值（LSM）呈正相关，对慢性肝病患者肝纤维化（F≥2）、进展期肝纤维化（F≥3）和肝硬化（F=4）的诊断AUC分别达0.78、0.83和0.90，为肝纤维化无创诊断提供了高效、自动化的新方案。

　　

1 引言

肝纤维化是影响慢性肝病患者预后的重要因素，也是各种慢性肝病发展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）的关键步骤。它是指肝脏细胞外基质（如胶原、糖蛋白、蛋白聚糖等）的弥漫性过度沉积和异常分布，是各种慢性肝病的病理结果。各种原因引起的肝细胞损伤、炎症反应和细胞凋亡均可诱导肝纤维化。尽管有针对病因的各种治疗方法（如抗病毒药物和免疫抑制疗法）可用于肝纤维化的治疗，但疗效有限。因此，准确、及时地评估肝纤维化水平，实现个体化治疗尤为重要。

高尔基体蛋白73（GP73）是高尔基体上的一种跨膜蛋白，在许多人体的组织上皮细胞中均有表达，但在正常肝细胞中几乎检测不到。它在各种急慢性肝病患者的肝细胞中高表达。当肝损伤发生时，GP73的氨基末端被切割，羧基末端释放到血液中。许多研究表明，GP73与慢性乙型肝炎（CHB）、慢性丙型肝炎（CHC）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、酒精性肝病（ALD）和自身免疫性肝炎（AIH）等慢性肝病中的肝纤维化和肝硬化密切相关。

在大多数情况下，GP73使用酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。深圳新产业生物医学工程股份有限公司（Snibe）最近开发了一种用于GP73的化学发光免疫分析法（CLIA），该检测方法尚未上市，仍处于实验阶段。

本研究包括三个部分。第一部分是测试该GP73检测试剂的的分析性能，分析的性能包括：回收实验、精密度、空白限（LoB）、检测限（LoD）、线性区间和抗干扰能力。第二部分是方法学比较，第三部分旨在评估CLIA检测的GP73水平在诊断慢性肝病患者肝纤维化和肝硬化中的临床价值。

2 材料与方法

2.1 分析性能

测试样本为Snibe生产的GP73抗原，纯度≥90%（SDS-PAGE）。原始浓度为1.994 mg/mL，稀释至不同浓度用于分析性能测试。

GP73测定使用高尔基体蛋白73检测试剂盒（CLIA）（Snibe）。使用Snibe生产的六台全自动CLIA分析仪：Maglumi 4000 Plus（M4000P）、Maglumi 2000 Plus（M2000P）、Maglumi 800（M800）、Maglumi X3（X3）、Maglumi X6（X6）、Maglumi X8（X8）。

回收实验使用所有六台分析仪和稀释的测试样本进行，使用回收率评估性能。

精密度通过批内精密度和批间精密度对所有六台分析仪进行评估。批内精密度使用一个批次的检测试剂对三个精密度参考样本各检测10次。批间精密度使用三个批次的检测试剂对三个精密度参考样本各检测10次。计算变异系数（CV），公式为CV = 标准偏差 / 平均值 × 100%。

空白限（LoB）通过测试空白样本（本研究使用PBS缓冲液）20次，并测量对应于分析仪发光（RLU）的“平均值 + 2×标准偏差”的浓度进行评估。

检测限（LoD）通过测试五个浓度为2.000 ng/mL的样本，每个样本检测5次进行评估。

线性区间通过测试六个稀释样本，然后进行线性相关分析对所有六台分析仪进行评估。

干扰实验将浓缩的血红蛋白、脂肪乳和胆红素溶液分别加入样本中作为干扰样本，使干扰样本中血红蛋白、脂肪乳和胆红素的浓度分别达到1000 mg/dL、2000 mg/dL和60 mg/dL。计算检测偏差，并确定其对GP73浓度的影响。

2.2 方法学比较

比较试剂盒为北京热景生物技术有限公司生产的商品化GP73-ELISA试剂盒。其线性范围为50–500 ng/mL，灵敏度≤25 ng/mL，批内精密度≤15 ng/mL。

使用MedCalc统计软件19.2.6版处理和分析数据。使用Spearman相关性分析检查比较试剂盒与Snibe GP73试剂盒之间的相关性。使用Bland-Altman分析（包括差异百分比的数据行为分析：方差齐性检验和比例偏倚）来检验比较试剂盒与Snibe GP73试剂盒之间的一致性。

2.3 临床价值

参考区间研究纳入一组肝功能正常、无肝炎病毒既往感染或现症感染的健康个体作为参考人群。计算GP73水平的中位数，并使用非参数方法确定总体样本的95%参考范围。

本研究纳入2022年9月至2023年5月在华中科技大学同济医学院附属协和医院和武汉大学人民医院登记的212例慢性肝病患者。患者纳入标准包括年龄大于18岁但低于80岁，诊断为CHB、CHC、NAFLD、ALD或AIH且病程超过六个月，曾进行肝脏瞬时弹性成像（TE）检测，并符合《瞬时弹性成像技术（FibroScan）临床应用共识及操作指南（2018年更新版）》和《肝纤维化诊断和治疗共识（2019年）》中的要求。排除标准包括存在其他肝病原因、既往肝移植、数据不完整、肥胖、肋间隙狭窄、存在明显腹水导致TE检测失败、一周内使用过甘草酸苷、水飞蓟宾等保肝降酶药物、有酗酒史。所有患者均知情同意本研究，并同意收集上述共识中涉及的患者相关临床诊断背景信息。本研究经华中科技大学同济医学院附属协和医院和武汉大学人民医院伦理委员会批准。

TE检测使用法国ECHOSENS公司的FibroScan-502 Touch进行，检测患者的肝脏硬度测量值（LSM）。由成功完成超过500次连续操作的操作员进行检测。根据共识，定义了所研究患者不同病因的LSM截断值。基于LSM，可以确定这些患者的METAVIR纤维化分期（F0/F1、F2、F3、F4）。

血清GP73水平使用Snibe生产的高尔基体蛋白73检测试剂盒（CLIA）检测，仪器为Snibe生产的全自动CLIA分析仪MAGLUMI X8。

使用SPSS 20.0.0软件处理和分析数据。对本研究的定量数据进行Shapiro-Wilk正态性检验。正态分布的数据变量以“均值±标准差”描述，其他以“中位数（四分位数1~四分位数3）”描述。组间比较使用Mann-Whitney U检验；不同变量之间的相关性使用Spearman相关性分析。使用受试者工作特征曲线下面积（AUC）评估血清GP73对所研究患者肝纤维化/肝硬化的诊断效能。p<0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 分析性能

回收实验结果显示，所有六台分析仪的回收率在94.37%至101.38%之间，在±10%以内。

精密度结果显示，批内精密度CV在1.06%至3.03%之间。批间精密度CV在0.99%至3.09%之间。批内和批间精密度均观察到满意的CV值（5%）。

空白限（LoB）测试中，所有六台分析仪测试空白样本，其对应于分析仪发光“平均值 + 2×标准偏差”的浓度均小于1 ng/mL。

检测限（LoD）测试中，所有分析仪的每次测试结果均小于3 ng/mL。

线性区间分析结果显示，所有六台分析仪的实际浓度与理论浓度之间的决定系数R2均大于0.99，表明所有不同分析仪均具有良好的线性。线性区间可定义为[4, 1000] ng/mL。

抗干扰能力结果显示，当样本中分别含有高达1000 mg/dL的血红蛋白、2000 mg/dL的脂肪乳和60 mg/dL的胆红素时，GP73-CLIA试剂盒的检测变异分别为-3.5%、-4.1%和3.6%，均在5%以内。

3.2 方法学比较

方法学比较研究中，使用GP73-CLIA试剂和商品化GP73-ELISA试剂盒进行评估。

Spearman相关性分析显示，两种试剂盒的定量结果呈正相关。相关系数r_s为0.997（p<0.05），回归方程为y = 1.096 + 0.982x。

数据行为分析结果显示，评估试剂与测量确认比较试剂对临床样本的差异百分比/均值无比例偏倚且方差齐性。一致性界限（LoA）上限为18.36%（95%CI：16.60%~20.13%），下限为-17.62%（95%CI：-19.39%~-15.86%）。在所有样本（n=303）中，有4个样本位于95% LoA区间之外。

3.3 临床价值

参考区间研究共有229名健康个体参与，年龄19至30岁（n=47）、31至40岁（n=44）、41至50岁（n=48）、51至60岁（n=47）、>60岁（n=43），其中男性108名，女性128名。研究结果表明，整体健康人群GP73的中位值为22.1 ng/mL，95%参考范围的上限为37.35 ng/mL。

疾病研究纳入212例慢性肝病患者，其中男性136例，女性76例，年龄21至80岁。纳入患者中，CHB患者145例，CHC患者11例，NAFLD患者26例，ALD患者14例，AIH患者16例。参考区间人群与疾病组的检测值差异有统计学意义（p<0.05）。

不同METAVIR分期GP73水平的比较显示，肝纤维化分期F0/F1（37例）、F2（80例）、F3（61例）和F4（34例）的平均GP73水平分别为34.30 ng/mL、41.37 ng/mL、49.70 ng/mL和80.42 ng/mL。随着肝纤维化METAVIR分期的增加，GP73水平也增加，差异具有统计学意义（p<0.001）。

GP73与LSM和METAVIR分期的相关性分析显示，GP73水平与LSM和肝纤维化METAVIR分期呈正相关：与LSM的Spearman相关系数r_s=0.51（p<0.001）；对肝纤维化METAVIR分期赋值后计算的Spearman相关系数r_s=0.47（p<0.001）。

基于METAVIR分期系统，使用AUC评估GP73-CLIA对慢性肝病患者肝纤维化的诊断效能。GP73诊断显著肝纤维化（F≥2）、进展期肝纤维化（F≥3）和早期肝硬化（F=4）的AUC分别为0.78、0.83和0.90。使用约登指数确定最佳截断值，其敏感性和特异性分别为：39.70 ng/mL（66.86%，78.38%）、40.80 ng/mL（71.57%，81.08%）、42.04 ng/mL（82.35%，83.78%）。

4 讨论

肝活检是诊断纤维化的金标准。然而，肝活检是一种有创检查，可能伴随并发症，限制了其普遍应用。血清标志物检测和影像学检查技术因其良好的耐受性、可接受性和可重复性，弥补了肝纤维化动态监测的困难。瞬时弹性成像是全球最常用的肝纤维化无创诊断影像技术。在中国，它也是评估CHB、CHC、NAFLD、ALD和AIH等慢性肝病患者肝纤维化程度的重要方法。目前，仍然缺乏对肝纤维化诊断具有高特异性的单一血清标志物。临床上，血清标志物对肝纤维化的诊断价值主要依赖于血液学无创诊断模型的联合检测，如FIB-4和APRI，但它们都存在局限性，包括但不限于适用疾病单一、诊断性能不稳定、适用人群有限等。因此，有必要探索能够有效且广泛应用于肝纤维化/肝硬化临床诊断的新血清标志物。

GP73是高尔基体上的一种跨膜蛋白，由Kladney等人于2000年首次发现。随后的研究发现，CHB、CHC、ALD和AIH患者的GP73水平显著高于正常人。近年来，许多研究表明GP73与慢性肝病患者的肝纤维化和肝硬化密切相关。Liu等人发现，GP73与包括遗传性疾病、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和先天性畸形在内的儿童慢性肝病肝纤维化的相关系数为0.338（p<0.001）。Yao等人发现，HBV患者中GP73与肝纤维化的相关系数为0.434（p<0.001）。Li等人发现，NAFLD不同阶段血清GP73与肝纤维化的相关系数为0.436（p<0.001）。

关于GP73对肝纤维化和肝硬化的诊断效能，Yao等人发现，对于病毒性肝炎，GP73诊断显著肝纤维化（F≥2）、进展期肝纤维化（F≥3）和早期肝硬化（F=4）的AUC分别为0.772、0.854和0.890；对于AIH，分别为0.855、0.852和0.880；对于NAFLD，分别为0.897、0.935和0.960。此外，Lu等人的专利研究发现，GP73诊断肝纤维化F≥2、F≥3和F=4的AUC、敏感性和特异性分别为0.828（64.92%，90.68%）、0.895（80.66%，86.49%）、0.933（82.61%，91.24%），证明GP73也能区分非乙型肝炎病毒感染引起的肝纤维化患者的显著肝纤维化和进展期肝纤维化。此外，An等人的研究进一步证实，GP73也适用于诊断除CHB外的慢性肝病患者不同严重程度的肝纤维化。

上述研究均证明了GP73对慢性肝病患者肝纤维化的诊断价值，但均使用ELISA进行。当从学术研究转向大规模临床应用时，ELISA显示出较差的成本效益。相比之下，本研究开发的CLIA试剂具有高通量和自动化的能力。GP73-CLIA检测完成从样本加载到结果报告的整个过程大约需要20分钟每样本，X8分析仪每批可处理300个样本。相反，ELISA需要手动、分步操作，每个样本的检测时间超过2小时。对于校准，每个CLIA试剂批次包含一个集成的标准曲线，消除了ELISA所需的额外校准步骤。此外，常规ELISA存在固有的局限性，特别是手动操作带来的污染风险较高。在分析性能方面，我们的GP73-CLIA试剂与现有的ELISA方法相比显示出显著优势。与商品化ELISA试剂盒制造商声称的分析性能相比，GP73-CLIA在线性范围（4–1000 ng/mL vs 50–500 ng/mL）、批内精密度（CV，≤10% vs ≤15%）和灵敏度（≤1 ng/mL vs ≤25 ng/mL）方面表现出更好的性能。

本研究纳入了在两个研究中心接受FibroScan检查的不同病因引起的212例慢性肝病患者。根据使用瞬时弹性成像技术FibroScan进行肝纤维化无创诊断的共识意见进行METAVIR分期。通过GP73-CLIA检测患者各分期的血清GP73水平。发现随着慢性肝病患者METAVIR分期的增加，肝纤维化程度加重，GP73水平逐渐升高（p<0.01）。随后，Spearman相关性分析显示，GP73与LSM和肝纤维化METAVIR分期呈正相关（r_s=0.51, p<0.0001；r_s=0.47, p<0.0001），相关程度与Li等人和Yao等人的研究结果一致。最后，本研究中GP73的诊断效能与Yao等人和Lu等人的结果基本一致。因此，GP73可考虑用于肝纤维化的辅助诊断和分期预测。我们认为它可以作为高危人群的筛查方法和患者分层工具。对于超过参考阈值（提示可能存在纤维化）的样本，特别是数值显著升高的样本，我们建议采用二次方法（如瞬时弹性成像或肝活检）来评估潜在患者的肝纤维化状况，并降低疾病低估的潜在风险。

我们的GP73-CLIA方法的优势可概括为三个方面。一、卫生经济学效益：GP73-CLIA具有高通量的优势。在提高检测效率的同时，显著降低了人力成本，使其适用于慢性肝病患者等高危人群的普筛，有利于分层管理。通过早期发现，可以早期检测肝纤维化，并节省晚期肝硬化的治疗成本。二、优异的分析性能：GP73-CLIA的线性范围优于其他商品化ELISA试剂盒。例如，在我们研究中的F4期肝纤维化病例中，最大浓度达到585.444 ng/mL。因此，宽线性区间覆盖了浓度极高的群体，从而最大限度地减少了人工稀释误差。在抗干扰方面，研究发现其对复杂样本（如肝病患者常见的血脂异常）具有兼容性，结果表明无干扰。三、临床性能：我们的研究结果表明，单独进行GP73检测可能有助于肝纤维化的辅助诊断和纤维化分期的预测。然而，不足之处首先在于缺乏肝纤维化分期的组织学诊断，因为肝活检是金标准。在进一步的研究中将纳入具有组织学诊断的患者。此外，有报道称血清GP73水平可能受肝脏炎症活动度的影响，本研究纳入定期随访的慢性肝病患者，未分析GPP3与肝脏炎症标志物（ALT、AST等）的相关性。这需要在未来进一步改进。此外，临床样本量较小，不同病因和健康对照的样本不足也应加以改善。最后，GP73与其他肝纤维化无创实验室血清标志物和影像学检查联合的诊断效能需要进一步深入研究。

5 结论

Snibe的CLIA GP73检测具有令人满意的分析性能，并且通过CLIA检测的GP73与肝纤维化分期和LSM呈正相关，在诊断和分期慢性肝病患者的肝纤维化和肝硬化方面具有重要的临床价值。