综述：CRISPR-Cas9：连接衰老机制与神经退行性疾病治疗进展的桥梁

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：CRISPR-Cas9: bridging the gap between aging mechanisms and therapeutic advances in neurodegenerative disorders

本综述系统探讨了CRISPR-Cas9基因编辑技术在神经退行性疾病治疗中的前沿应用，重点解析其如何靶向衰老相关分子机制（如DNA损伤、线粒体功能障碍、蛋白聚集），为阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）等难治性疾病提供从基因层面干预的新策略，并深入讨论了递送系统、安全性挑战及未来临床转化方向。

　　

引言

神经退行性疾病是一类以神经元结构和功能进行性丧失为特征的疾病，最终导致神经元死亡。随着全球人口老龄化，阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓小脑共济失调（SCA）等疾病日益 prevalent，构成重大全球健康挑战。衰老是这类疾病最重要的风险因素，与DNA损伤、线粒体功能障碍和蛋白质聚集等分子过程交织在一起。

衰老在神经退行中的作用

衰老作为一个基本的生物学过程，通过导致身体和功能能力下降而增加疾病和死亡风险。在神经退行性疾病中，它是最重要的风险因素。衰老通过多种方式影响神经退行过程：异常蛋白聚集物如Aβ、高度磷酸化tau和α-突触核蛋白常见于老年人脑组织；衰老还影响神经可塑性，增加大脑对遗传和环境因素的易感性。例如，载脂蛋白E（APOE）ε4等位基因是晚发性AD的关键易感基因。

连接衰老与神经退行性疾病

神经退行和衰老构成一个连续体，衰老特征如蛋白质稳态丧失、线粒体功能障碍和基因组不稳定性影响着神经退行性疾病的发病和进程。分子研究表明，大脑衰老可能是神经退行的加速形式，特别是在极高龄人群中。发育过程中的环境暴露（如创伤或毒素）可能产生长期后果，使个体在晚年更容易患神经退行性疾病。

当前和新兴疗法

目前治疗主要侧重于症状管理：乙酰胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐）用于AD；NMDA受体拮抗剂（如美金刚）；多巴胺激动剂用于PD；抗精神病药物用于神经精神症状；免疫调节物质旨在减少脑部炎症。基因治疗作为一种新兴方法，通过将新的或修饰的基因引入大脑来治疗疾病。最近的治疗方法专注于抗淀粉样蛋白和抗tau疗法，但这些疗法不能阻止神经元变性或大脑萎缩的进展。CRISPR/Cas9等先进基因修饰方法为干预提供了新途径。

革命性治疗：CRISPR-Cas基因编辑的承诺

CRISPR-Cas9系统是近年来最具革命性的科学突破之一。这一RNA引导的基因组编辑平台允许在哺乳动物细胞中进行精确的遗传修饰。该系统通过创建双链断裂（DSB），然后通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复。

递送方法包括病毒载体（AAV、慢病毒、腺病毒）、mRNA、质粒和基于蛋白质的方法（如核糖核蛋白复合物RNP）。每种方法都有其优势：AAV具有组织嗜性、在非分裂细胞中的染色体外持久性和低基因组整合率；mRNA方法提供瞬时功能，避免基因组整合风险；RNP复合物提供增强的特异性、减少脱靶效应和提高效率。

阿尔茨海默病（AD）

AD是进行性神经疾病的主要死亡和残疾原因之一，其特征是记忆障碍和认知能力下降。Aβ肽的积累形成淀粉样斑块，与神经原纤维缠结（NFT）一起构成AD的主要神经病理学特征。

虽然大多数AD病例是散发性的，但一小部分是家族性的（FAD），由APP、PSEN1或PSEN2基因的致病性变异引起。CRISPR-Cas9技术已成功用于纠正PSEN2 N141I变异，恢复生理性Aβ42/Aβ40比率；敲除PSEN1基因减少Aβ42和Aβ40产生；消除瑞典APP（APPswe）突变降低Aβ蛋白表达。

对于散发AD，APOE基因是重要风险因素，其中APOE4型是最强的遗传风险因子。研究使用CRISPR将APOE4等位基因纠正为E3/E3基因型，结果显示E3神经元表现出降低的磷酸化tau蛋白数量，并且对离子霉素驱动的细胞毒性更具抵抗力。

帕金森病（PD）

PD是第二常见的神经退行性疾病，主要影响55岁以上人群。其特征是运动功能受损，由于黑质致密部（SNPC）多巴胺产生不足导致。

约90%的PD患者病因不明（特发性），10%有家族性PD，由PRKN/PARK2、SNCA、PINK1、LRRK2等基因突变引起。SNCA基因与α-突触核蛋白表达密切相关，A53T错义突变是PD的重要风险因素。

研究使用CRISPR-Cas9技术精确下调SNCA基因mRNA，限制其蛋白表达；在患者来源的iPSCs中修改A53T和SNCA三倍突变，发现该基因缺失可抵抗Lewy体病理形成；在猪模型中成功敲除PARK2和PINK1基因；研究还发现DNAJC6功能丧失突变通过损害WNT-LMX1A信号传导影响多巴胺能神经元发育。

亨廷顿病（HD）

HD是一种常染色体显性遗传的进行性神经系统疾病，由亨廷顿蛋白基因中CAG三核苷酸重复扩增引起，产生扩展的聚谷氨酰胺链。

CRISPR/Cas9技术通过定制等位基因选择性方法，基于SNPs修改原间隔相邻基序（PAM），特异性灭活突变HTT等位基因；使用同源非依赖性靶向整合（HITI）方法有效消除核酸；在HD140Q-KI小鼠模型中非等位基因特异性消耗HTT，显著改善运动功能障碍和减少反应性星形胶质细胞；在R6/2小鼠模型中靶向突变HTT基因，神经毒性包涵体发育减少两倍，寿命延长，运动神经缺陷改善。

肌萎缩侧索硬化（ALS）

ALS是一种快速进展的运动系统疾病，由中枢神经系统运动神经元功能障碍引起，导致肌无力、萎缩、瘫痪，最终因呼吸衰竭死亡。

约10%为家族性ALS（fALS），90%为散发性。C9orf72、SOD1、TARDBP和FUS是常见致病基因。C9orf72基因的非编码区六核苷酸序列重复是ALS常见原因。

研究使用AAV载体传递CRISPR-Cas9系统消除C9ORF72基因座中的HRE，降低RNA焦点、聚二肽和单倍体不足等重要标志物；在转基因小鼠中编辑hSOD1-G93A转基因；在ALS患者iPSCs中修复SOD1 E100G突变，并分化为运动神经元。

脊髓小脑共济失调

SCAs是一组主要影响小脑的进行性神经退行性疾病，以常染色体显性方式遗传，特征为稳定性和敏捷性进行性下降。

超过40种遗传不同亚型已被发现，可分为非重复突变和动态重复扩展突变引起的两类。至少12种SCAs由重复扩展突变引起，其中6种由编码序列中的CAG三核苷酸重复扩增产生扩展的聚谷氨酰胺链，称为多聚谷氨酰胺SCAs。

研究使用CRISPR技术通过靶向破坏ATXN3基因座中的致病性CAG三核苷酸重复来降低mATXN3；在SCA3-iPSCs中使用双sgRNA/Cas9n切口酶方法结合同源重组成功修复74重复CAG扩展；开发SCA3-iPSCs一步遗传修复有效方法；在SCA1患者成纤维细胞中使用G3和G8 guide RNA/Cas9核糖核蛋白组装体减少健康和突变ATXN1蛋白合成。

未来方向、局限性与结论

尽管衰老和神经退行性疾病研究取得了长足进步，但仍然缺乏能够真正预防或逆转这些疾病的治疗方法。最大挑战之一是缺乏能够准确模拟人类大脑神经退行过程的有效疾病模型。

CRISPR/Cas9基因编辑是最有前景的发展之一，使科学家能够精确编辑与神经退行性疾病相关的基因。早期动物研究显示 promising 结果，但在应用于人类医学前仍存在重大障碍。

基因治疗面临几个关键挑战：脱靶效应导致意外编辑；递送问题由于尺寸大导致血脑屏障穿透效率低；CRISPR/Cas9诱导的DNA损伤在p53充足细胞中激活细胞周期阻滞和凋亡；细胞类型特异性要求更高精度；预先存在的对Cas9的免疫反应（体液和细胞介导的适应性免疫）；免疫原性反应。

神经退行性疾病的散发性质也是重要限制，CRISPR仅适用于靶向已知单基因原因的罕见家族形式。此外，还必须考虑伦理和监管障碍，包括患者同意、长期安全监测和种系编辑。

未来有效治疗神经退行性疾病的路径取决于如何将衰老、遗传学和先进技术的知识整合在一起：创建更好模型捕捉衰老和疾病特征；精心选择与其他生物系统协调工作的基因靶点；改进基因编辑工具递送方法同时最小化副作用；探索将基因治疗与药物或其他治疗结合的联合方法。

尽管前路漫长，但正在取得的进展给我们带来希望。通过持续研究和合作，我们正越来越接近为数百万患有这些毁灭性疾病的人们开发出真正有效的治疗方法。