单细胞RNA测序揭示B细胞亚群在原发性干燥综合征发病机制中的关键作用及I型干扰素通路调控网络

《Frontiers in Immunology》：B cell subpopulations and their role in the pathogenesis of primary Sj?gren’s syndrome: insights from single-cell RNA sequencing

本研究通过单细胞RNA测序技术深度解析原发性干燥综合征（pSS）患者外周血B细胞亚群的转录组特征，发现记忆B细胞（Bmem）、初始B细胞（NaiveB）和浆细胞（PlasmaCells）在I型干扰素（IFN-I）信号通路、B细胞受体（BCR）克隆性及免疫球蛋白重链（IGHV/IGHJ）基因重排等方面存在显著异常。研究首次通过伪时序分析揭示pSS患者B细胞分化轨迹加速现象，并通过qRT-PCR验证关键基因ISG15的显著上调，为阐明B细胞通过IFN-I通路参与pSS发病机制提供了新证据。

　　

1 引言

原发性干燥综合征（pSS）是一种以淋巴细胞增殖和外分泌腺进行性损伤为特征的慢性炎症性自身免疫疾病。患者血清中存在多种自身抗体，除唾液腺和泪腺功能障碍外，还可出现多器官和多系统受累。pSS的病因尚不明确，但研究表明通过干扰素（IFN）通路破坏先天免疫屏障在pSS发病机制中起关键作用。单细胞RNA测序（scRNA-seq）作为一种高通量单细胞水平RNA测序分析新技术，能够分析细胞间及细胞亚群间的差异，为解析pSS的病理机制提供了新视角。

2 材料与方法

2.1 研究对象

研究纳入宁夏医科大学总医院风湿免疫科首次确诊的25例pSS患者作为pSS组，同期体检的25例健康人群作为健康对照（HC）组。随机选取每组3例进行单细胞测序，剩余22例用于qRT-PCR验证。

2.2 研究方法

通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMCs），使用SCOPE-chip?微流控芯片进行单细胞测序。采用CeleScope v1.14.0和Scanpy v1.8.2进行质量控制、降维和聚类分析，并通过GO/KEGG富集分析、转录因子调控网络、细胞通讯、伪时序轨迹和BCR谱系分析等生物信息学方法深入解析B细胞亚群特征。

3 结果

3.1 pSS与HC组外周血单细胞类型及差异基因分析

共捕获65,670个细胞（pSS组34,221个，HC组31,449个），聚类鉴定出8种主要细胞类型。在2,938个B细胞中进一步识别出记忆B细胞（Bmem）、初始B细胞（NaiveB）和浆细胞（PlasmaCells）三个亚群。pSS组NaiveB（71.70% vs 67.65%）和PlasmaCells（2.70% vs 0.67%）比例升高，而Bmem比例降低（25.61% vs 32.35%）。差异表达基因分析显示IGHM、IGLC2、MS4A1等B细胞标志基因显著上调。

3.2 pSS组B细胞亚型差异基因比较与功能富集分析

GO/KEGG分析显示，pSS组Bmem和NaiveB细胞中MX1、IFI44L、ISG15、STAT1等基因显著上调，主要富集于I型干扰素信号通路、抗原加工提呈和MHC II类分子结合等过程。浆细胞中ISG15、IFI6、STAT1等基因参与内质网蛋白加工和抗体分泌功能。

3.3 pSS组B细胞亚型转录因子分析

转录因子分析发现，Bmem细胞中NR2F6和IRF5显著上调，NaiveB细胞中STAT2、IRF9、THRB和BATF3上调，浆细胞中AHR、ZFP64、ARID3A和XBP1上调。这些因子共同构成IFN-I信号通路的转录调控网络。

3.4 细胞通讯网络分析

细胞互作分析显示B细胞与单核吞噬细胞（MPs）相互作用最为频繁，主要通过TNFSF10–TNFRSF10C、TGFB1–TGFBR3等配体-受体对进行信号传导。

3.5 pSS与HC组B细胞亚型伪时序分析

伪时序轨迹分析构建出B细胞从NaiveB经Bmem向PlasmaCells分化的动态路径。pSS组NaiveB在效应分支起始段比例显著增加，提示分化进程加速。基因表达动态显示早期应激反应基因（JUN、FOS）逐渐下降，晚期免疫球蛋白基因（IGHG1、IGHA1）和浆细胞标志基因（XBP1、MZB1）持续上调。

3.6 BCR分析

BCR谱系分析显示pSS组浆细胞克隆扩增现象显著。IGHV基因使用频率分析发现pSS组IGHV4-34使用率升高（9.3% vs 3.9%），浆细胞中IGHJ4/IGHJ6使用频率增加，而IGHV1-3、IGHV1-69D和IGHV2-7D使用率降低。

3.7 qRT-PCR分析

qRT-PCR验证显示pSS患者外周血（p < 0.0001）和纯化B细胞（p = 0.0076）中ISG15表达显著上调，证实scRNA-seq结果的可靠性。

4 讨论

本研究通过单细胞多组学分析系统阐释了B细胞亚群在pSS发病机制中的重要作用。研究发现I型干扰素信号通路关键基因（ISG15、IFI44L、STAT1等）的持续激活、B细胞分化轨迹的加速、BCR克隆性改变及IGHV-J基因重排异常共同构成pSS的免疫病理特征。特别值得注意的是，转录因子IRF5、STAT2、IRF9的上调进一步强化了IFN-I通路的正反馈循环。伪时序分析首次揭示pSS患者B细胞过早进入效应分化路径的现象，为临床干预提供了新的时间窗口靶点。

研究的局限性在于样本量较小且未对B细胞亚群进行分离验证。未来需要开展纯化B细胞亚群的功能实验和更大样本的多中心研究，以明确IFN-I信号在pSS B细胞异常活化中的具体机制。