下丘脑-垂体-卵巢轴转录组分析揭示欧洲肉鸽与石岐鸽产蛋间隔差异的分子机制

《Frontiers in Genetics》：Transcriptome profiling of hypothalamus-pituitary-ovary axis provides insights into egg-laying interval differences between european meat pigeons and shiqi pigeons

本研究通过转录组测序比较欧洲肉鸽与石岐鸽下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO轴）基因表达差异，发现卵巢组织中差异表达基因最多（199个），并揭示甲状腺激素信号通路（ hypothalamus-pituitary）与类固醇激素生物合成通路（ovary）是调控产蛋间隔的关键通路，鉴定出StAR、EYA1、HAND2、HOXB8、NRN1等关键基因，为缩短鸽子产蛋间隔、提高繁殖效率提供了重要分子靶点和理论依据。

　　

1 引言

鸽子因其高营养和高蛋白特性而备受消费者青睐，中国古代医学典籍《本草纲目》记载“一鸽胜九鸡”，充分表明鸽子是具有极高营养价值的食材。鸽肉富含矿物质元素和维生素，还具有药用价值，肉质细嫩滑爽，易于消化吸收，是人类理想的滋补食品。与其他家禽相比，鸽子具有一夫一妻制、诱导排卵和亲鸽喂养雏鸽等独特的繁殖特性。鸽子每个产蛋周期仅产两枚蛋，两蛋间隔48小时。自然孵化和喂养条件下，两次产蛋期之间的间隔为30-40天。种鸽每年仅产约20-28枚蛋，年产16至22只雏鸽。产蛋间隔是衡量鸽子产蛋相关性状的重要指标之一，不同品种鸽子之间存在显著差异。

欧洲肉鸽具有优异的繁殖性能和极高的生产力，平均产蛋间隔约为31天，还具有强大的育雏能力等优异繁殖性能。石岐鸽产于中国广东省中山县石岐地区，是肉赏兼用型鸽子，已有百余年历史，具有性情温顺、适应性强、耐粗饲和良好筑巢行为等特点，平均产蛋间隔约为32天。

家禽繁殖依赖于下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）中一系列生殖激素的调节。下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO）控制母鸡的生殖过程，影响卵泡的选择、发育、闭锁和排卵。鸡的产蛋过程涉及HPO轴协调的一系列激素变化。下丘脑的视前区和弓状核神经元可分泌促性腺激素抑制激素（GnIH）和促性腺激素释放激素（GnRH），这是下丘脑中一对极其重要的调节神经肽，在家禽HPG的激素调节中起关键调节作用。中枢神经系统分析和整合来自外部刺激和自我反馈的各种信息，下丘脑接收这些信息后，以脉冲方式释放GnRH，刺激垂体前叶释放卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）。FSH和LH主要作用于卵巢，促进卵泡成熟，并分泌雌激素（E2）和孕酮（P），从而维持母鸡的产蛋状态。此外，下丘脑和垂体还分泌其他激素和神经肽，通过HPG参与调节禽类卵巢类固醇激素合成、卵泡发育和排卵，如生长激素（GH）、催产素和催乳素。

2 材料方法

2.1 实验动物

本实验以欧洲肉鸽和石岐鸽为研究对象。每个品种选择300对鸽子，进行6个月的繁殖表型数据统计分析，包括产蛋数、受精蛋数、产蛋间隔和孵化率。随后随机选择5只2-2.5岁雌性欧洲肉鸽和石岐鸽进行屠宰，采集下丘脑、垂体和卵巢组织，立即在液氮（-196°C）中冷冻，然后储存在-80°C冰箱中备用。所有实验均按照中国机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行，伦理批准代码为HNUAHEER 2425106。

2.2 RNA提取、文库构建和测序

按照制造商指南，使用Trizol Reagent Kit提取总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估提取的总RNA质量，并通过无RNase污染的琼脂糖凝胶电泳进一步验证。随后去除rRNA。使用BGI Optimal Series Dual Module mRNA Library Construction Kit进行文库制备。首先通过变性处理分离mRNA，然后使用oligo（dT）磁珠进行富集。mRNA片段化后，使用片段化试剂处理产生更小的片段。通过使用来自这些mRNA片段的随机六聚体引物进行逆转录，合成第一链cDNA。接着合成第二链cDNA。然后修复cDNA的3'末端并添加A碱基，随后连接接头。PCR扩增后，将PCR产物变性成单链。未环化的线性DNA被消化，产生单链环状文库。最终，phi29扩增产生DNA纳米球（DNB），在BGI的测序平台上使用高密度DNA纳米孔技术以及cPAS和PE100/PE150方法进行测序。

2.3 生物信息学分析

使用SOAPnuke（v1.5.6）对来自欧洲肉鸽（EH, EP, EO）和石岐鸽（SH, SP, SO）HPO轴组织的原始测序数据进行质量过滤，获得clean reads。随后使用Dr. Tom多组学数据挖掘系统进行数据分析、绘图和挖掘。进行差异基因分析。为了进一步深入探索相关基因功能，使用基于超几何检验的Phyper对差异基因进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。以P值<0.05为阈值，满足此条件的定义为候选基因中显著富集。

2.4 数据处理

使用独立样本t检验比较不同品种间的产蛋间隔。使用SPSS 27.0软件进行统计分析，数据以平均值±标准差（Mean ± SD）表示。

3 结果

3.1 繁殖表型统计

对300对欧洲肉鸽和300对石岐鸽进行6个月的统计分析显示，繁殖表型指标存在差异。在检测的指标中，只有产蛋间隔在两个品种间表现出显著差异。产蛋数、受精蛋数和孵化率均未观察到显著差异（P值>0.05）。欧洲肉鸽的产蛋间隔（32.76 ± 3.25天）显著短于石岐鸽（33.11 ± 3.86天，P=0.024）。

3.2 差异表达分析

使用转录组测序技术分析石岐鸽和欧洲肉鸽的下丘脑、垂体和卵巢组织。数据过滤后，从30个样本中获得总共191.4 Gb的clean reads，平均每个样本的clean数据为6.38 Gb，平均映射到参考基因组的比率为77.33%。所有样本的Q20为98.5%–98.77%，Q30为94.06%–95.14%。在SH vs EH、SP vs EP和SO vs EO的比较中，分别鉴定出39个（11个上调和28个下调）、101个（56个上调和45个下调）和199个（143个上调和56个下调）差异表达基因（DEGs），筛选条件为FDR <0.05且|log2（倍数变化）| ≥ 2。总体而言，两个鸽种HPO轴组织中的基因表达存在显著差异，卵巢组织的DEGs数量最多（199个），表明卵巢是调控产蛋间隔的关键组织。

3.3 差异表达基因功能分析

富集分析提供了最详细的GO术语信息，有助于深入分析HPG轴调控不同品种鸽子产蛋间隔的机制。我们关注生物过程（BP）并选择了前30条通路进行重点分析。在SH vs EH组中，DEGs主要与过渡金属离子稳态、离子运输、金属离子稳态相关。此外，我们注意到与繁殖调节相关的通路，如调节受体介导的内吞作用、甲状腺激素运输、调节受体介导的内吞作用、调节中心体复制、调节环化酶活性、视黄醇/类视黄醇代谢过程。在SP vs EP组中，DEGs主要分配给钙介导的信号传导、细胞内信号转导、第二信使介导的信号传导、细胞周期调节、细胞信号传导以及细胞形态发生和粘附。在SO vs EO组中，大多数DEGs与感觉器官发育、神经系统发育、胚胎形态发生、胚胎器官形态发生、类固醇生物合成过程、系统发育相关。

3.4 KEGG通路富集分析

对HPG轴相关组织中的差异基因进行KEGG通路富集分析。SH vs EH组中鉴定出的DEGs主要富集在铁死亡、矿物质吸收、胆汁分泌、HIF-1信号通路、鞘糖脂生物合成-球系和异球系、神经活性配体-受体相互作用等通路。在垂体中，DEGs主要富集在Th1和Th2细胞分化、破骨细胞分化、谷氨酸能 synapse、肌醇磷酸代谢、鞘糖脂生物合成-球系和异球系、铁死亡通路。值得注意的是，甲状腺激素信号通路在下丘脑和垂体组织中均被富集，这是一个先前报道参与繁殖调节的通路。在卵巢中，DEGs富集在神经活性配体-受体相互作用、醛固酮合成和分泌、类固醇激素生物合成、酪氨酸代谢、cAMP信号通路、多巴胺能 synapse、调节肌动蛋白细胞骨架、皮质醇合成和分泌、醛固酮调节的钠吸收等通路。

3.5 基因表达聚类分析

表达模式分析用于对不同鸽种HPO轴中表达的基因的基因表达变化趋势进行分类，并推断不同组织间表达基因的可能关系和特定功能。石岐鸽和欧洲肉鸽HPO轴中表达的基因被聚类为总共10个簇。根据它们的动态表达变化，我们选择了两组具有相反表达趋势的簇进行分析。在欧洲肉鸽中，簇4和簇5具有相反的表达趋势。GO功能富集分析显示，簇4中的基因主要与基因表达、RNA代谢过程、细胞氮化合物代谢过程等功能相关；簇5中的基因主要与细胞通讯、信号传导、细胞内信号转导、信号转导、轴突发育、细胞形态发生相关。在石岐鸽中，簇1和簇10具有相反的表达趋势。簇1基因的GO功能富集分析显示，它主要与调节运动、神经系统发育、调节多细胞生物发育等功能相关。簇10基因的GO功能富集分析显示，它主要与有机氮化合物代谢过程、氮化合物代谢过程、大分子修饰等功能相关。总之，我们发现欧洲肉鸽簇5和石岐鸽簇1中表达的基因存在一些相似性，它们大多与细胞或组织的生长发育、神经系统发育、心脏瓣膜发育、正向调节细胞生长、正向调节发育生长、正向调节细胞群体增殖相关。

3.6 通路-基因相互作用网络分析

类固醇激素在鸽子产蛋间隔期间起着至关重要的调节作用。在产蛋间隔期，类固醇激素维持在相对较高的浓度水平，这为卵泡的正常发育提供了坚实保证。基于此，我们整理了卵巢组织中参与类固醇激素产生或胚胎发育过程的差异表达基因和相关通路信息，并绘制了基因-通路网络图，旨在进一步揭示鸽子生殖生理的奥秘，为提高鸽子繁殖性能奠定坚实基础。如图所示，在卵巢组织中，我们鉴定出诸如固醇代谢过程、C21-固醇激素生物合成过程、胆固醇代谢过程等通路。鉴定出类固醇生成急性调节蛋白（StAR）。这个关键基因在类固醇激素合成过程中起着关键的调节作用。此外，我们还鉴定出胚胎形态发生、系统发育、胚胎发育和器官发育等通路（P < 0.05），并且还鉴定出一些基因，如EYA1（eyes absent homolog 1）、HAND2（heart and neural crest derivatives-expressed protein 2）、HOXB8（homeobox b8）、NRN1（neuritin 1）和ELAVL4（elav-like rna binding protein 4）。这些基因可以同时出现在多个通路中，这表明在鸽子卵巢的整体发育调控网络系统中，它们很可能扮演极其关键和复杂的角色，深刻影响鸽子卵巢从胚胎发育初始阶段到成熟卵泡形成的一系列复杂过程，从而可能从根本上对产蛋间隔这一重要繁殖性状产生决定性影响。

4 讨论

鸽子养殖在全球范围内具有重要的经济意义。随着人们对优质蛋白质需求的不断增加，鸽业持续发展壮大。然而，由于鸽子特殊的生殖功能，其产蛋间隔相对较长，限制了高效育种。事实上，不同品种的肉鸽在繁殖性能上表现出显著差异，但相关机制尚不清楚。

产蛋间隔是鸽子繁殖性能的关键指标，先前的研究已报道了显著的品种特异性差异。在本研究中，我们通过6个月的表型调查进一步验证了欧洲肉鸽和石岐鸽的这一性状。我们的表型统计显示，欧洲肉鸽的产蛋间隔（32.76 ± 3.25天）显著短于石岐鸽（33.11 ± 3.86天，P=0.024），这与先前关于两个品种繁殖特性的报道一致。尽管绝对值存在细微差异，但一致的趋势证实产蛋间隔差异是一个稳定的品种特异性状，为后续下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的转录组分析提供了可靠基础。

产蛋性能是家禽生产中重要的经济性状之一。HPO轴在调节动物生殖生理中起着核心作用。在鸽子中，HPO轴协调一系列关键的生殖过程，从性成熟启动、卵泡发育、排卵到激素分泌。然而，目前对肉鸽HPO轴的研究仍然相对有限。现有研究证实，不同鸽种表现出不同的繁殖性能——一些表现出高繁殖力且产蛋间隔短，而另一些则繁殖力较低，但驱动这些差异的分子机制——尤其是HPO轴中的基因表达模式、激素调节网络和信号转导通路如何塑造这种表型变异——在很大程度上仍不清楚。在此背景下，我们的研究收集了欧洲肉鸽和石岐鸽在产蛋间隔期间的下丘脑、垂体和卵巢组织进行转录组测序，旨在鉴定与产蛋间隔相关的关键基因和调控网络。

GO功能分析显示，与繁殖相关的生物过程在HPO轴组织中存在差异富集：在下丘脑中，DEGs明确富集于直接参与繁殖调节的过程，如甲状腺激素运输；在卵巢中，DEGs富集于与繁殖相关的发育过程，如胚胎形态发生、胚胎器官形态发生和类固醇生物合成过程——这是卵泡成熟和排卵的核心通路。对于垂体，虽然未检测到明确标记为繁殖的生物过程，但富集的通路包括钙介导的信号传导、细胞内信号传导，这些是生殖激素分泌的重要上游调节环节，为垂体在HPO轴中作为“信号中继站”的作用提供了功能基础。总的来说，这些组织特异性的富集特征及其协调的功能效应共同反映了HPO轴在塑造鸽子产蛋间隔方面的综合调控机制。

KEGG通路富集分析发现，在前20条通路中，甲状腺激素信号通路在下丘脑和垂体中均被富集，该通路已被证实通过调节LH和FSH等激素的合成和分泌参与生殖轴的调节。在下丘脑中，甲状腺激素激活酶基因Dio2和失活酶基因Dio3的平衡表达对于光周期诱导的性腺发育至关重要。此外，甲状腺激素（THs）通过多种机制影响生殖过程：它们调节关键生殖激素的分泌和功能，直接与雌激素、孕酮、FSH、LH和催乳素相互作用影响卵巢和子宫功能，并调节HPG轴中GnRH的释放。这一作用在进化上是保守的，如在哺乳动物中——甲状腺切除术会破坏绵羊的季节性生殖转变，强调了甲状腺激素信号通路是系统发育上保守的繁殖调节器。

在卵巢组织中，差异表达基因的KEGG分析显示，类固醇激素生物合成通路显著富集，这与卵泡发育和排卵密切相关。类固醇激素是卵泡发育和排卵的核心，其合成基因在卵泡成熟过程中表现出阶段特异性表达模式。孕酮是该通路中的一种关键类固醇激素，不仅驱动卵泡发育，还是雄激素和雌激素合成的前体；在家禽中，它主要由卵泡颗粒细胞合成。生物合成过程始于类固醇生成急性调节蛋白（StAR）将胆固醇运输到线粒体内膜，在那里胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）将其转化为孕烯醇酮——这是类固醇生成的奠基步骤。研究发现，随着火鸡等级卵泡的发育和成熟，孕酮的合成不断增加，而睾酮和雌二醇的合成量不断减少。排卵前六小时，鸡血清中的孕酮水平升高。孕酮可以刺激排卵前LH峰的形成。这些发现共同表明，甲状腺激素信号通路（下丘脑-垂体）和类固醇激素生物合成通路（卵巢）是产蛋间隔的协调者和调节者。前者控制上游生殖激素的分泌，而后者控制下游卵泡的成熟和排卵时间。这种组织特异性通路富集与HPO轴的功能划分相一致，为理解鸽子产蛋间隔的品种特异性差异提供了分子框架。

在细胞色素氧化酶的作用下，胆固醇在线粒体内转化为氧固醇。卵巢中的卵泡膜细胞和颗粒细胞利用它合成生殖激素。StAR基因编码的蛋白质在类固醇激素合成的急性调节阶段起关键作用，可促进胆固醇转化为孕烯醇酮。其作用机制是介导胆固醇从线粒体外膜运输到线粒体内膜，然后裂解胆固醇生成孕烯醇酮。先前的研究表明，StAR不仅存在于肾上腺、睾丸和卵巢等类固醇激素产生组织中，而且还广泛分布于许多其他组织中，并且其在卵巢中的表达水平相对较高。StAR在卵巢发育和排卵过程中具有不可或缺的作用。此外，与胚胎和组织器官发育相关的基因，如EYA1、HAND2、HOXB8和NRN1，也值得关注。EYA1不仅在体节发生过程中表达，还参与其他器官的形态发生。HAND2属于碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族，在胚胎发生过程中表达于心脏、肢芽和许多神经嵴衍生物中。HAND2基因敲除（HAND2^?/?）的小鼠表现出右心室严重发育不全和生长迟缓的表型。Hoxb8基因是同源框基因家族的成员。该家族在进化过程中高度保守，并在脊髓背侧发育和胚胎骨骼系统形态发生等多个过程的上游或内部发挥调节功能。卵巢发育机制以及胚胎和组织器官发育机制，为提高鸽子繁殖性能提供了坚实的理论基础和新的研究思路。

5 结论

本研究通过对欧洲肉鸽和石岐鸽的下丘脑、垂体和卵巢组织进行转录组测序，鉴定出差异表达基因（DEGs）。在它们的HPO轴组织中发现了显著的基因表达差异，其中卵巢显示的DEGs最多（199个），表明它是调节产蛋间隔的关键组织。通路富集分析揭示，甲状腺激素信号通路（在下丘脑和垂体中共同富集）和类固醇激素合成通路（在卵巢中富集）很可能是产蛋间隔的核心调控通路：前者通过控制生殖激素分泌来调节产蛋周期，而后者通过影响卵泡成熟来影响产蛋间隔。鉴定出包括StAR（类固醇合成相关）以及EYA1、HAND2、HOXB8、NRN1（胚胎和组织发育相关）在内的关键基因，这些基因可能通过调节类固醇激素合成和卵泡发育来影响产蛋间隔。本研究增进了对HPO轴调节产蛋间隔的理解，并可能有助于提高鸽子的繁殖效率。