靶向N-钙黏蛋白/β-连环蛋白轴逆转慢性髓系白血病急变期恶性表型

《Frontiers in Oncology》：Targeting the N-cadherin/β-catenin axis with MSAB reverses malignant phenotypes in blast crisis of CML

本综述聚焦慢性髓系白血病（CML）从慢性期（CP）向急变期（BC）进展的关键分子机制。研究通过生物信息学分析鉴定出进展特异性基因，并证实N-钙黏蛋白（CDH2）通过激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路促进细胞增殖、抑制分化。采用β-连环蛋白抑制剂MSAB可有效逆转上述恶性表型，为BC-CML提供了新的治疗策略。

　　

1 引言

慢性髓系白血病（CML）是一种由BCR::ABL融合酪氨酸激酶驱动的造血系统恶性肿瘤。疾病通常从慢性期（CP）逐步进展为加速期（AP）和致命的急变期（BC），后者类似于急性髓系白血病（AML），以分化受阻为特征。尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）能够诱导缓解并阻止疾病进展，但仍有相当比例的患者会进入急变期，且治疗选择有限。白血病干细胞（LSC）理论认为，只有一小部分白血病干细胞具有维持生长和导致疾病复发的能力。研究表明，除了BCR::ABL本身，RUNX1/EVI1、GATA-2和Msi2等基因的异常激活也与CML的急性转化有关。然而，驱动CML从慢性期向急变期转化的遗传事件尚未完全阐明。目前已知的遗传异常包括导致TP53破坏的17号染色体短臂等臂染色体，以及较少见的P15/P16肿瘤抑制基因缺失。

大多数关于N-钙黏蛋白（N-cadherin, CDH2）的研究集中在实体瘤，对其在白血病，特别是CML进展中作用的研究较少。本研究旨在识别慢性期向急变期转变过程中的遗传改变，并寻找潜在的预后标志物或治疗靶点。通过对GSE4170数据集进行生物信息学再分析，研究者识别出一组在疾病各阶段均表现出一致表达趋势的核心基因，其中N-钙黏蛋白被确定为可能促进CML进展的候选分子之一。

2 材料与方法

2.1 数据来源

从GEO数据库下载已发表的CML基因表达数据集GSE4170及其原始CEL文件。该数据集包含119例CML患者在不同疾病阶段和随访时间点的样本。为关注未经治疗的疾病进展，研究者排除了治疗后缓解样本，保留了91例未经治疗的病例：慢性期（CP, n = 42）、加速期（AP, n = 17）和急变期（BC, n = 32）。使用RMA算法对原始CEL文件进行背景校正、分位数归一化和log₂转换。探针集使用NetAffx Release 36进行注释。使用limma包进行差异表达分析，对比组包括CP vs AP、AP vs BC和CP vs BC，显著性阈值设定为Benjamini–Hochberg FDR < 0.05且 |log₂ 倍数变化| ≥1。使用clusterProfiler包进行GSEA分析，报告的q值经过FDR校正。GSEA的显著性阈值设定为FDR q值 < 0.25。

2.2 患者样本

从浙江省中医院获取7例慢性期和7例加速期或急变期CML患者的外周血标本，用于验证微阵列结果。

2.3 细胞系、培养与转染

人CML细胞系KU812由国家细胞库（上海）提供。细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。使用慢病毒转染KU812细胞以过表达N-钙黏蛋白，然后用2 μg/mL嘌呤霉素筛选稳定细胞系。

2.4 定量实时PCR

使用RNAiso Plus试剂盒提取和纯化总RNA，使用PrimeScript? RT Master Mix试剂盒将RNA反转录为cDNA。随后使用TB Green? Premix ExTaq?（Tli RNaseH Plus）试剂盒在ABI Prism? 7500实时PCR检测系统上进行qPCR检测。使用2^-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达量，以GAPDH为内参。

2.5 细胞凋亡与细胞周期检测

使用Annexin V/PI凋亡试剂盒和细胞周期染色试剂盒，在流式细胞仪上检测细胞凋亡和细胞周期。

2.6 细胞增殖检测

使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）进行增殖分析。将细胞接种于96孔板，加入CCK-8试剂孵育2小时后，用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

2.7 流式细胞术

使用针对CD34、CD117、CD33、CD13、CD11b、CD16、CD10的荧光标记抗体对细胞进行染色，然后通过流式细胞术分析细胞表面标志物的表达。

2.8 免疫缺陷小鼠皮下成瘤实验

将4-5周龄的裸鼠在细胞接种前用环磷酰胺预处理3天。收集处于对数生长期的细胞，洗涤后以每只小鼠1×10⁷个细胞的数目注射到裸鼠右腋下。将小鼠随机分为两组：实验组接种过表达N-钙黏蛋白的细胞，对照组接种转染对照质粒的细胞。每隔一天监测小鼠体重和肿瘤生长情况。

2.9 伦理声明

本研究经浙江中医药大学机构伦理委员会批准（批准号：2021-KL-099-01）。伦理委员会规定实体瘤大小不得超过动物总体重的10%，或当肿瘤达到3000-3500 mm³大小时停止观察。

2.10 蛋白质印迹分析

按照先前描述的方法进行蛋白质提取和分离。使用的一抗包括：抗CDH2、抗GSK-3β、抗β-连环蛋白、抗c-Myc、抗CCNE1、抗P53和抗微管蛋白；抗p-GSK-3β、抗CCND1、抗CDK2和抗CDK4。膜与HRP标记的二抗孵育1小时后，使用Western ECL底物显影，并用ChemiDox XRS+系统分析。

2.11 细胞因子阵列

将等量细胞培养48小时，收集上清液，通过流式细胞术的磁珠法分析6种细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。

2.12 统计分析

实验结果以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism软件进行分析。两组间比较使用非配对双尾Student’s t检验。多组比较使用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Tukey’s事后检验。使用Tukey’s或Bonferroni事后检验进行多重比较校正。P值小于0.05认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 识别CML中的进展特异性基因

为探索CML的急变期转化，研究者获取了GEO数据库中的GSE4170数据集以筛选关键基因。差异表达分析揭示了在加速期（AP）与慢性期（CP）以及急变期（BC）与AP的比较中，分别有641和755个基因差异表达。基因集富集分析（GSEA）用于注释这些转变相关的功能通路。主要功能组包括核基因表达、线粒体代谢、RNA结合、细胞粘附、细胞因子-细胞因子受体相互作用和粒细胞通路，表明晚期疾病与增殖和代谢增强相关。研究者随后对所有1294个差异表达基因以及三个疾病阶段交集内的102个差异表达基因进行了趋势分析。这组在从慢性期向急变期转变过程中表现出一致表达趋势的基因被定义为“进展特异性”基因集。基于GO和KEGG功能注释对进展特异性基因集的功能进行分类。在晚期，这些主要功能组包括造血和分化的负调控、线粒体代谢、凋亡信号通路，以及MAPK级联和蛋白酪氨酸激酶活性的正调控。这些通路的激活可能使得疾病在BCR::ABL激活通路被治疗性抑制的情况下仍能进展。此外，在41个交集基因中，只有SOCS2、PTGR2和CDH2表达水平升高，其余基因在进展过程中表达均下降。分析表明这些基因可能在CML的进展中发挥了关键作用。

3.2 CML急变期患者中N-钙黏蛋白表达升高

GSE4170的生物信息学分析提示CDH2可能是人类CML进展的关键驱动因子。此外，相关性分析表明CDH2 mRNA水平与原始细胞百分比之间存在弱相关性。为验证这一假设，研究者检测了处于不同进展阶段的CML患者外周血标本中N-钙黏蛋白和β-连环蛋白的mRNA水平。qPCR分析显示，N-钙黏蛋白的mRNA水平在慢性期患者中较低，但在晚期患者中显著升高。此外，发现β-连环蛋白的mRNA水平在晚期有升高趋势，但差异未达到统计学显著性。推测N-钙黏蛋白和β-连环蛋白可能对CML向急变期进展产生重要影响。为阐明CML进展不同阶段骨髓组织中免疫细胞的组成，研究者进行了免疫浸润分析，以评估和量化免疫细胞浸润及免疫微环境。发现造血干细胞（HSC）、巨核细胞-红系祖细胞（MEP）和前脂肪细胞的富集分数与CML疾病进展持续相关，呈现显著上升趋势。相反，嗜酸性粒细胞、单核细胞和中性粒细胞的富集分数与CML进展呈负相关，也显示出统计学显著差异。

3.3 N-钙黏蛋白在增殖和分化中的功能

为验证N-钙黏蛋白在CML中的功能，研究者构建了OE-N-cad慢病毒载体并将其导入至少携带一个费城染色体（Ph1）的KU812细胞中。随后通过蛋白质印迹和实时PCR证实OE-N-cad显著增加了N-钙黏蛋白的表达。接着使用CCK8实验评估细胞增殖。N-钙黏蛋白过表达在48小时后促进了细胞增殖。由于N-钙黏蛋白过表达影响细胞分裂，研究者进一步通过流式细胞术进行细胞周期分析。与对照相比，N-钙黏蛋白过表达减少了G1期细胞比例，增加了S/G2/M期细胞比例，也表明增殖增强。此外，通过流式细胞术分析细胞表面分化抗原发现，N-钙黏蛋白过表达阻碍了细胞分化，表现为CD34表达增加，同时CD13和CD10表达减少。这些发现表明细胞增殖和分化在一定程度上呈负相关。

3.4 N-钙黏蛋白在体内加速肿瘤形成和增殖

为了在体内进一步证实高表达N-钙黏蛋白细胞的影响，研究者将转染了OE-N-cad慢病毒载体以及阴性对照慢病毒载体的细胞皮下注射到裸鼠体内。肿瘤监测显示，与对照组相比，N-钙黏蛋白过表达组的肿瘤形成速率显著加快，到第11天时，83%（6只中的5只）的裸鼠出现可见肿瘤，而对照组直到第17天才最终有60%的裸鼠荷瘤。此外，接种了过表达N-钙黏蛋白细胞的裸鼠表现出更快的肿瘤生长和更早的体重下降。这些发现有力地支持了N-钙黏蛋白在促进KU812细胞体内增殖中的关键作用。

3.5 MSAB逆转N-钙黏蛋白对细胞增殖和分化的影响

研究者通过q-PCR检测发现，在过表达N-钙黏蛋白的细胞中，β-连环蛋白、GSK3β、c-Myc、CCND1、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6的转录水平显著增加。这些基因中的大多数是Wnt信号通路的下游靶标。因此推测β-连环蛋白可能是一个关键的调节因子。为研究β-连环蛋白是否介导这些效应，研究者用特异性β-连环蛋白降解剂MSAB处理细胞16小时。CCK-8和细胞周期实验证实，MSAB显著抑制细胞增殖，减少DNA复制，并诱导G2/M期阻滞。流式细胞术凋亡实验显示，MSAB处理显著诱导了早期凋亡。分化标志物分析表明，MSAB部分恢复了分化，降低了CD34表达并轻微升高了CD10表达。鉴于细胞因子与分化之间的相互作用，研究者还通过流式细胞术的细胞因子微球阵列对细胞因子进行了研究。结果表明，N-钙黏蛋白过表达导致IL-6水平显著下降，而MSAB处理后IL-6水平有轻度回升。这些数据共同证明，β-连环蛋白对于N-钙黏蛋白诱导的促增殖和抗分化效应是必需的。

3.6 N-钙黏蛋白通过调节β-连环蛋白在CML进展中发挥作用

本研究探讨了造血恶性肿瘤细胞中细胞周期蛋白和经典Wnt/β-连环蛋白信号通路的表达。qPCR结果显示，N-钙黏蛋白过表达诱导了细胞周期蛋白（CCND1, CDK6）和Wnt/β-连环蛋白信号通路靶基因（如β-连环蛋白和c-Myc）的显著上调，而这些上调在MSAB处理后显著减弱。免疫印迹也表明，N-钙黏蛋白表达上调导致CCND1、CCNE1、β-连环蛋白和c-Myc的蛋白水平升高，而添加MSAB则显著降低了这些蛋白水平。这些结果表明N-钙黏蛋白通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调节增殖和分化，提示其在CML进展中起关键作用。

4 讨论

本研究的整合分析确立了N-钙黏蛋白/β-连环蛋白轴是慢性髓系白血病（CML）急变期的关键驱动因子。患者样本的转录组分析显示，CDH2（N-钙黏蛋白）在整个疾病进展过程中持续上调，并在急变期达到峰值。这一临床观察在体外和体内得到了功能验证：N-钙黏蛋白过表达促进了增殖、细胞周期进程和肿瘤生长，同时抑制了髓系分化。关键的是，这些恶性表型依赖于β-连环蛋白信号，因为它们可被β-连环蛋白抑制剂MSAB有效逆转，MSAB恢复了分化并使细胞周期停滞。

急变期是一个由协同突变（如TP53、ASXL1、RUNX1）和信号通路重排（JAK/STAT、PI3K/AKT、Wnt/β-连环蛋白）驱动的多步骤过程。本研究并非取代这些范式，而是将CDH2/β-连环蛋白轴定位为一个额外的分子驱动因子，这个先前未被充分认识的轴心可以独立运作或与经典病变协同作用。这一观点与最近的单细胞研究结果一致，后者显示无论TP53状态如何，急变期样本中均存在异质性的β-连环蛋白激活。

本研究的数据与越来越多表明N-钙黏蛋白参与白血病的证据相符。它在多种血液系统恶性肿瘤中高表达，并与AML中的原始CD34+表型相关，这与我们发现CDH2抑制分化抗原（CD13/CD10）的结果一致。其作用超越了细胞自主效应；CDH2促进了骨髓归巢和微环境相互作用，从而促进生存和耐药性。重要的是，CDH2的致癌功能并不局限于KU812急变期模型。在慢性期（K562）和加速期（LAMA-84）CML细胞系中的研究同样表明，CDH2增强了集落形成和增殖能力，而其敲低则抑制了生长。此外，在人CD34+祖细胞中功能性阻断N-钙黏蛋白可促进粒细胞分化并降低克隆形成能力，这直接支持了我们的机制结论，并强调了该通路在CML各阶段的广泛意义。

研究者观察到CDH2过表达降低了IL-6分泌和粒细胞分化抗原，暗示了可能存在微环境反馈环路。然而，本研究未进行与骨髓基质细胞（如HS-5或MS-5）的共培养实验或3-D类器官系统实验。未来的工作有必要采用此类模型，以明确确立CDH2信号如何影响以及如何被微环境影响。

在机制上，本研究提供了令人信服的证据，表明β-连环蛋白是致癌性CDH2信号的关键下游介质。经典Wnt靶标（CCND1, c-MYC, CDK6）的上调以及MSAB引起的深刻表型逆转有力地支持了这一论断。一个有趣的观察是，MSAB介导的β-连环蛋白降解也降低了N-钙黏蛋白的蛋白水平，这提示可能存在一个正反馈环路，其中β-连环蛋白可能在转录或转录后水平稳定CDH2。阐明这种调控的分子基础是未来研究的一个诱人方向。

虽然本研究数据表明强制表达CDH2可加速增殖并抑制粒细胞分化，但早先有两项研究报告了看似相反的效果。这些差异可以通过考虑细胞背景来调和。总之，这些比较强调了CDH2的致癌输出是高度背景依赖性的：中等程度的表达维持慢性期的生存，而达到急变期水平的过表达则劫持了Wnt/β-连环蛋白轴，以牺牲分化为代价来强制增殖。

值得注意的是，β-连环蛋白抑制剂MSAB仅部分逆转了N-钙黏蛋白驱动的分化阻滞、细胞因子失衡和细胞周期阻滞。虽然MSAB有效恢复了早期凋亡和增殖，但成熟髓系抗原的重新表达仍然有限，IL-6水平也只是略有恢复。这种不完全的表型逆转提示，可能存在额外的β-连环蛋白非依赖性通路（如Notch或Jak/Stat信号）与CDH2协同维持急变期程序，这一假设值得在未来研究中通过组合靶向进行验证。

研究者坦率承认本研究的局限性，这也为未来的研究指明了方向。尽管患者数据具有参考价值，但队列规模有限，研究结果需要在更大的独立队列中进一步验证。功能研究主要在KU812细胞中进行；尽管在K562和LAMA-84细胞中的补充数据重现了增殖和克隆形成效应，但由于基线表达水平低，尚未实现CDH2的基因敲低。体内模型虽然证明了CDH2的促肿瘤作用，但使用的是皮下异种移植模型。更具生理相关性的全身性或原位模型能更好地模拟播散性疾病和微环境相互作用。最后，CDH2过表达的更广泛基因组背景仍有待探索。在未来工作中整合转录组或多组学分析可能揭示协同的遗传事件。

尽管存在这些局限性，本研究明确地将CDH2/β-连环蛋白轴确定为CML进展中增殖-分化失衡的有效驱动因子。MSAB在逆转这些表型（包括伊马替尼耐药模型）中的有效性，使得靶向该通路成为治疗急变期的一种有前景的策略。未来的努力应侧重于评估β-连环蛋白抑制剂（单独使用或与TKIs联用）在原发性患者样本和高级动物模型中的效果，最终目标是克服定义CML这一侵袭性阶段的治疗耐药性。