通过宏转录组分析揭示与牛乳腺炎相关的转录活跃病原体的分子特征

《Frontiers in Veterinary Science》：Metatranscriptome analysis to unveil the molecular signatures of transcriptionally active pathogens associated with bovine mastitis

牛乳腺炎是一种由复杂微生物群落引起的多病因疾病，本研究首次利用代谢转录组学方法分析公开的双RNA测序数据集，鉴定出25个转录活跃病原菌属（包括Pseudomonas、Stenotrophomonas等新病原体），揭示其携带4121个毒力蛋白、484个蛋白酶、74个抗生素耐药基因，并发现益生菌（Blautia、Bacillus、Lactobacillus）与病原菌在微生物互作网络中呈负相关，为开发多表位疫苗和微生物组疗法提供新方向。

　　牛乳腺炎是一种多病因的疾病，影响奶牛的健康、奶产量和奶质，对奶农造成显著的经济损失。与此同时，治疗牛乳腺炎时对抗生素的使用和滥用也加剧了抗菌素耐药性（AMR）问题。因此，深入研究与牛乳腺炎相关的病原体及其分子机制对于开发新的诊断和治疗策略至关重要。当前，许多基于16S rRNA和全基因组测序（WMGS）的研究已经揭示了与牛乳腺炎相关的微生物种类，但这些方法在解析病原体的转录活性和功能特征方面存在局限性。例如，16S测序主要提供属级别的分类信息，而无法区分活性和非活性细菌，且缺乏对功能和代谢过程的深入了解。相比之下，转录组学方法，尤其是宏转录组学，能够提供更全面的病原体基因表达信息，从而揭示其在宿主环境中的功能活动和分子特征。

本研究利用公开的牛乳腺炎双RNA-Seq数据集，采用计算方法进行宏转录组分析，以识别转录活性的病原体及其相关的分子特征。通过分析未映射到牛基因组的RNA-Seq数据，研究人员发现了25种活跃的病原体属，共涉及约500种细菌株。这些发现包括一些新兴病原体，如假单胞菌属（*Pseudomonas*）、斯腾诺特罗福蒙斯菌属（*Stenotrophomonas*）、康莫纳菌属（*Comamonas*）和鞘脂单胞菌属（*Sphingomonas*），它们在疾病发展中扮演了重要角色。此外，研究还揭示了4,121种毒力蛋白、484种蛋白酶、432种分泌蛋白以及74种抗菌素耐药基因的表达特征，为开发多表位疫苗和诊断工具提供了潜在目标。

在宏转录组分析中，研究人员还构建了微生物共现网络，以评估有益菌群（如*Blautia*、*Bacillus*和*Lactobacillus*）与病原体之间的相互作用。结果表明，这些有益菌群与病原体之间存在负相关关系，提示通过调节微生物群落可能为治疗亚临床乳腺炎提供新的策略。例如，*Blautia*和*Lactobacillus*这类具有益生特性的菌群在疾病发生时其丰度下降，而*Bacillus*菌属则可能同时包含病原体和益生菌，因此其丰度可能在健康条件下更为显著。这种微生物群落的动态变化为理解宿主与病原体之间的相互作用提供了重要线索。

本研究还发现，某些病原体的毒力蛋白、蛋白酶和分泌蛋白在牛乳腺炎中高度表达，这些蛋白可能参与宿主细胞的侵袭、免疫逃逸和毒性作用。例如，*Pseudomonas*菌属在宏转录组中表现出极高的转录活性，不仅包含大量毒力蛋白（1952种），还表现出丰富的蛋白酶（231种）和抗菌素耐药基因（44种）。这表明*Pseudomonas*在牛乳腺炎的病程中起着核心作用，尤其是在对抗生素的耐受性方面。此外，*Stenotrophomonas*菌属虽然相对不为人知，但其毒力基因（1226种）和分泌蛋白（170种）的数量表明其在疾病发生中具有重要作用。*Mycoplasma*菌属虽然在毒力基因数量上不如*Pseudomonas*，但其在病原体特异性方面表现出高度专一性，可能与特定的感染机制相关。

本研究通过宏转录组学方法揭示了牛乳腺炎病原体的复杂性，不仅包括已知的病原体，如*Staphylococcus aureus*、*Escherichia coli*和*Streptococcus uberis*，还涵盖了新兴病原体。这些病原体的转录活性和功能特征为开发新的诊断工具和治疗策略提供了依据。例如，研究发现一些假设蛋白和未表征蛋白可能在宿主-微生物相互作用中发挥关键作用，包括细菌效应蛋白的转移、免疫系统的逃逸以及模拟宿主蛋白功能。这些蛋白的存在可能暗示病原体在宿主体内具有更复杂的适应机制，例如通过逆转录酶和转座子相关基因促进基因组的快速进化，以适应不同的宿主环境。

此外，研究还发现，抗菌素耐药基因在多个病原体中广泛存在，如*Pseudomonas*和*Escherichia*菌属。这些基因可能通过不同的机制，如抗生素外排泵、抗生素修饰酶和靶点保护蛋白，赋予病原体对多种抗菌药物的耐受性。这提示在治疗牛乳腺炎时，需更加关注抗菌素耐药性的潜在影响，并探索新的治疗策略以减少对传统抗生素的依赖。

通过宏转录组分析，研究还揭示了不同微生物群落之间的共现关系。例如，*Klebsiella*与*Bacillus*、*Lactobacillus*等有益菌群之间存在负相关，这可能与它们在宿主环境中的竞争或排斥作用有关。这些发现为理解微生物群落的动态变化提供了新的视角，并可能为开发基于微生物组的治疗策略提供理论支持。

尽管本研究取得了一些重要的进展，但其仍存在一定的局限性。例如，不同研究使用的实验设计、测序方法和数据分析策略存在差异，这可能导致结果的不一致性。此外，转录水平并不总是与蛋白质丰度或活性直接相关，因此需要进一步的实验验证。此外，本研究主要依赖于计算方法和公开数据，缺乏实际的体外验证，这可能影响研究结论的可靠性。

综上所述，本研究通过宏转录组学方法揭示了牛乳腺炎病原体的复杂性，并为开发新的诊断和治疗策略提供了重要的分子依据。研究结果不仅有助于理解病原体的致病机制，还为未来研究提供了方向，特别是在抗菌素耐药性和微生物群落调节方面。未来的研究可以进一步结合实验验证和多组学分析，以更全面地揭示牛乳腺炎的微生物生态和病原体动态，从而为改善奶牛健康和减少抗生素使用提供更有效的解决方案。