暹罗芽孢杆菌CCT8089：一种促进玉米和大豆生长的新型溶磷细菌

《Frontiers in Plant Science》：Bacillus siamensis CCT8089: a novel phosphate-solubilizing bacterium enhancing maize and soybean growth

本研究系统评价了暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）CCT8089菌株的溶磷和植物促生能力。体外实验表明该菌株能耐受渗透胁迫、产生胞外多糖（EPS）和生物膜，与商业接种剂（巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense和慢生大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum）兼容，并对病原真菌（Macrophomina phaseolina和Sclerotinia sclerotiorum）具有拮抗活性。该菌株能分泌有机酸（如苹果酸、乙酸、葡萄糖酸和乳酸）和植物生长素（IAA），并在温室实验中显著增加玉米根生物量。田间试验证实，通过种子处理或沟施应用CCT8089能显著提高玉米和大豆的产量及磷获取效率（PUE），且在玉米上沟施效果更佳。研究凸显了CCT8089作为新型微生物接种剂在提升热带农业磷利用效率方面的潜力。

　　

引言

磷（P）是植物生长必需的常量营养元素，参与DNA、RNA、ATP、NADPH和磷脂等重要生物分子的构成，并直接涉及呼吸作用和光合作用过程。根系吸收磷的主要形式是正磷酸盐（Pi，H₂PO₄?/HPO₄2?）。在高度风化的土壤（如大多数巴西土壤）中，仅有不到3%的总磷可被植物直接利用。这种低利用率主要归因于无机磷被铁（Fe）和铝（Al）氧化物的活性表面所固定，尤其在酸性热带土壤中，磷与这些金属离子强烈结合，降低了其移动性和植物有效性。

在热带地区，施用磷肥对满足作物营养需求至关重要，但此举效率低下，仅约10-30%的施用的磷被作物吸收，大部分残留在土壤中形成巨大的残留磷库（称为遗留磷），以植物难以利用的形式积累。全球磷资源有限且分布集中，使热带农业高度依赖进口。因此，提高磷利用效率（PUE）的策略备受关注，包括选育高效磷利用品种、采用精准农业技术以及使用能够溶解磷的微生物接种剂。

溶磷微生物（PSMs）在土壤磷循环中扮演关键角色，能将不溶性磷（如钙、铁、铝磷酸盐）和有机磷化合物转化为正磷酸盐，从而提高作物的PUE。这些微生物的主要溶磷和矿化机制包括产生和排泄有机酸以及分泌水解酶（如植酸酶和磷酸酶）。有机酸（如柠檬酸、草酸、苹果酸）通过酸化根际环境和络合金属离子来释放磷；而植酸酶和磷酸酶则负责降解有机磷化合物（如植酸），释放出无机磷。

在众多PSMs中，芽孢杆菌属（Bacillus）因其作为植物根际促生细菌（PGPR）的多功能性而备受青睐，不仅能够溶磷和矿化磷，还能产生铁载体、植物激素等生物活性代谢物，具有良好的根际定殖能力、抗逆性以及针对土传病原菌的生防活性。

本研究旨在体外表征暹罗芽孢杆菌CCT8089菌株，评估其溶磷和植物促生能力，并探究其作为新型溶磷剂和生长促进剂在玉米和大豆作物中的农艺潜力，同时比较种子处理和沟施两种施用方法的效果。

材料与方法

研究所用的暹罗芽孢杆菌CCT8089菌株分离自玉米根际土壤，因其显著的溶磷能力和对土传病原真菌（如立枯丝核菌Rhizoctonia solani、菜豆壳球孢Macrophomina phaseolina和腐皮镰刀菌Fusarium solani）的抗真菌活性而被选中。实验以巨大芽孢杆菌CNPMS B119（B119）和枯草芽孢杆菌CNPMS B2084（B2084）作为对照菌株。

体外分析涵盖了多个方面：通过在高渗培养基（含405 g/L山梨醇）上培养评估渗透胁迫耐受性；通过观察菌落形态和乙醇沉淀法检测胞外多糖（EPS）产生；采用结晶紫染色法量化生物膜形成能力；通过铬天青（CAS）法定量铁载体产生；利用Salkowski试剂比色法测定吲哚-3-乙酸（IAA）产量；通过测定对硝基苯磷酸盐（pNPP）的水解来评估酸性和碱性磷酸酶活性；以及通过特定培养和测定方法分析细胞内和细胞外植酸酶活性及植酸盐矿化能力。此外，还进行了菌株间相容性测试（交叉划线法）以及对病原真菌菜豆壳球孢和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的直接拮抗试验（双培养法）。

有机酸生产分析采用高效液相色谱法（HPLC），检测了菌株在含有不同磷源（Ca₃(PO₄)₂、FePO₄或AlPO₄）的NBRIP培养基中培养后产生的草酸、葡萄糖酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。

通过扫描电子显微镜（SEM）观察了CCT8089菌株在大豆种子表面和根部的定殖情况。种子经消毒后用CCT8089发酵液处理，培养7天后取样，经过固定、脱水、临界点干燥和喷金后镜检。

温室实验在装有沙土混合物的盆中进行，玉米种子经CCT8089接种（100 mL/60,000粒种子）后播种，45天后测定地上部和根部干物重。

田间试验在巴西多个地点进行，评估了两种生物制品（暹罗芽孢杆菌CCT8089和商业产品BiomaPhos?）通过种子处理（SD）和沟施（FA）两种方式对玉米和大豆的影响。试验设置了不同的接种剂量，并以仅施磷肥（83.25和111 kg P₂O₅ ha?1）的处理作为对照。测定了作物产量、籽粒磷含量、磷获取效率（PUpE）、磷利用效率（PUtE）和磷利用效率（PUE）。数据采用方差分析（ANOVA），并使用Lin和Binns提出的稳定性指数评估产量稳定性。

结果

体外分析

所有测试的芽孢杆菌菌株（CCT8089、B119和B2084）均表现出耐受水分胁迫、产生EPS和生物膜的能力。它们与巴西固氮螺菌（Ab-V5和Ab-V6）和慢生大豆根瘤菌（SEMIA 5079）相容。然而，只有CCT8089菌株对核盘菌和菜豆壳球孢表现出拮抗活性。

在铁载体产生方面，B119和B2084菌株的值最高。对于IAA产生，B2084最高（46.32 μg mL?1），其次是CCT8089和B119（分别为8.08和4.73 μg mL?1）。CCT8089、B119和B2084的细胞外植酸酶活性分别为8.31、3.09和2.85 mU mL?1，而细胞内植酸酶活性分别为49.12、37.39和34.18 mU mL?1。植酸盐矿化值分别为23.17、17.50和24.12 mg L?1。

所有菌株均显示出酸性和碱性磷酸酶活性。对于酸性磷酸酶，在使用FePO₄和AlPO₄作为磷源时，CCT8089的活性最高（分别为1436.16和1440.00 μg pNP mL?1 h?1）。对于碱性磷酸酶，CCT8089在使用FePO₄和AlPO₄时也显示出最高活性。

在有机酸生产方面，菌株在使用Ca₃(PO₄)₂作为磷源时表现出更高的有机酸生产能力。CCT8089菌株的能力最强，在Ca₃(PO₄)₂、FePO₄和AlPO₄中分别产生275.8、38.0和12.5 mmol L?1的有机酸。对于Ca₃(PO₄)₂，CCT8089主要产生苹果酸（147.7 mmol L?1），其次是乳酸、乙酸、琥珀酸、葡萄糖酸和草酸。B119主要产生葡萄糖酸，而B2084主要产生苹果酸。对于FePO₄，CCT8089和B119主要产生葡萄糖酸。对于AlPO₄，CCT8089主要产生乳酸。

根部定殖体内试验

扫描电镜图像显示，未接种的种子种皮和根部没有微生物。而用CCT8089处理的种子沿种皮脊和凹陷处附着有大量的杆状细胞，并形成微菌落。播种七天后，接种的幼苗根部表皮和根毛被广泛定殖，细胞常嵌入无定形的胞外物质中，并呈簇状排列，显示出早期生物膜形成的迹象。

温室实验

在温室实验中，CCT8089菌株显著增加了玉米植株的根干重，与未接种的对照相比增加了38.3%。对于地上部干重，处理间未观察到显著差异。

田间试验 – 产量

在玉米田间试验中，所有变异来源均对产量有显著影响。大多数接种芽孢杆菌菌株的处理比未接种对照（83.25 kg P₂O₅）表现出更高的生产力。沟施（FA）比种子处理（SD）有效9.11%。在SD处理中，CCT8089（50和100 mL/100 kg种子）和BiomaPhos（100 mL/100 kg种子）分别比对照增产8.2%、8.5%和1.5%。在FA处理中，CCT8089（100和200 mL/ha）和BiomaPhos（200 mL/ha）分别比对照增产10.19%、22.82%和14.18%。按地点分析，CCT8089 FA（200 mL）处理在Londrina、Guarapuava、Rio Verde和Barretos环境中表现出最高的平均产量。大多数生物制品处理表现出比对照更高的产量稳定性。

对于大豆栽培，生物接种剂处理也比未接种对照（83.25 kg P₂O₅）获得更高产量，但施用方法之间未检测到显著差异。在SD处理中，CCT8089（100 mL）和BiomaPhos表现突出，分别比对照增产10.1%和9.8%。在FA处理中，CCT8089（200 mL）的增产幅度最高，达14.9%。在不同地点，生物制品的增产效果各异，但总体而言，使用生物制品也带来了更高的产量稳定性。

田间试验 – 磷利用效率

在玉米实验中，所有变异来源均对PUpE和PUE有显著影响，但对PUtE未检测到显著差异。大多数生物接种剂处理显示出比对照更高的PUpE和PUE值。施用方法之间对这些性状没有显著差异。在SD处理中，CCT8089（100 mL）在PUpE和PUE方面均表现出最高的效率指数。在FA处理中，CCT8089（100 mL）在PUpE方面表现突出，而BiomaPhos（200 mL）在PUE方面表现最佳。按环境分析，PUpE和PUE的反应存在变异，表明环境条件影响了这些性状。

在大豆栽培中，所有与PUE相关的变异来源均观察到显著效应。大多数生物接种剂处理显示出比对照更高的PUE值，施用方法之间无差异。在SD处理中，CCT8089 SD（100 mL）和BiomaPhos SD（100 mL）记录的PUE值最高。在FA处理中，CCT8089（200 mL）是最有效的处理。按环境分析，CCT8089 FA（200 mL）在Faxinal、Londrina和Barretos与对照有显著差异，CCT8089 SD（100 mL）在Faxinal、Guarapuava和Rio Verde与对照有显著差异。

讨论

芽孢杆菌属（Bacillus spp.）因其在营养溶解和植物促生方面的作用而被广泛认可，是开发农业接种剂的关键属。本研究中，暹罗芽孢杆菌CCT8089表现出耐受水分胁迫、产生EPS和生物膜的能力，这些特性对于适应和定殖根际环境至关重要。SEM图像证实了该菌株在 soybean 根组织中的定殖能力。

CCT8089菌株与巴西成熟的商业接种剂（如巴西固氮螺菌和慢生大豆根瘤菌）相容，这种相容性允许这些微生物之间产生协同相互作用，增强对宿主植物的益处。此外，该菌株对重要的土传病原真菌表现出拮抗活性，突出了其多功能潜力。

三种芽孢杆菌菌株产生植酸酶和磷酸酶的能力突出了它们水解有机磷化合物的潜力，使磷更易被植物吸收。植酸是土壤中有机磷的主要形式之一，可占总有机磷的50%。植酸酶产生菌（如某些芽孢杆菌菌株）的存在可以通过从植酸化合物中释放无机磷来增强磷的有效性。磷酸酶（酸性和碱性）在磷动员中也起着至关重要的作用，因为它催化磷酸单酯键的水解，将有机磷转化为植物可利用的形式。

菌株CCT8089和B119在使用Ca₃(PO₄)₂时比使用FePO₄和AlPO₄时产生更多的有机酸，这可能反映了磷源溶解度的差异以及菌株水平的代谢调控。铁磷和铝磷通常仅在较低pH值和/或存在强金属螯合酸的情况下才能被动员，这对微生物提出了更高的代谢需求。在CCT8089中，不同磷源下酸谱的变化与这些机制一致：使用Ca₃(PO₄)₂时，较高的苹果酸和乙酸产量可以酸化介质并螯合Ca2?；使用FePO₄时，较高的葡萄糖酸产量与其对金属离子的亲和力以及络合Fe3?的能力相符；而在AlPO₄存在下观察到的乳酸产生则暗示了一种特定的铝螯合机制。

除了溶解和矿化磷酸盐外，这些芽孢杆菌菌株还表现出产生IAA的能力，IAA是一种对根系生长至关重要的植物激素。IAA刺激根系发育，增加吸收表面积，并增强包括磷在内的养分吸收。这种促根系生长能力在温室实验中得到了进一步证实。

基于田间结果，接种CCT8089菌株和BiomaPhos接种剂（含B119和B2084）提高了大豆和玉米作物的产量，其中玉米沟施效果显著。这些接种剂使得减少磷肥用量的处理能够获得与完全磷肥对照相当的产量。此外，这些处理提高了PUE，证明了这些微生物在刺激根系生长、溶解磷和矿化有机磷方面的潜力。稳定性指数分析表明，接种芽孢杆菌，特别是CCT8089菌株，有助于提高产量稳定性，确保在不同环境条件下获得更均匀的生产反应。

结论

暹罗芽孢杆菌CCT8089展现出一系列强大的植物促生特性，包括有机酸分泌、磷酸酶/植酸酶活性、铁载体和IAA产生、EPS/生物膜形成以及渗透胁迫耐受性，并能有效定殖大豆根部。温室试验中，CCT8089增加了根生物量。在重复的多环境田间试验中，接种（种子处理或沟施）相较于未接种对照（83.25 kg P₂O₅ ha?1）提高了玉米和大豆的籽粒产量和磷获取效率。在玉米上，沟施效果优于种子处理，最佳施用量为200 mL ha?1。在大豆上，两种施用方式效果相似，种子处理在100 mL/50 kg种子时有效。值得注意的是，CCT8089在不同环境条件下提供了更高的产量稳定性。这些发现表明CCT8089是一种有前景的热带农业溶磷细菌接种剂，具有提高磷利用效率和减少对矿物磷投入依赖的潜力。