综述：滤泡辅助性T细胞（Tfh）的空间分布和表型特征异质性

《Frontiers in Immunology》：Follicular helper T cells (Tfh): heterogeneity in spatial distribution and phenotypic characteristics

本综述系统阐述了滤泡辅助性T细胞（Tfh）在空间分布（GC-Tfh、FM-Tfh、cTfh）和功能表型（Tfh1、Tfh2、Tfh17）上的异质性，并探讨了其发育调控（如BCL6-BLIMP1轴）、可塑性模型（印记性与de novo）及其在感染、自身免疫病、癌症等疾病中的关键作用。文章创新性地提出整合Tfh、Tph及黏膜Tfh样细胞的系统框架，为理解体液免疫调控及开发靶向疗法提供了新视角。

　　

1 引言

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是适应性体液免疫中一类特殊的CD4⁺ T辅助细胞亚群。其命运由谱系定义转录因子B细胞淋巴瘤蛋白6（BCL6）主导，在T细胞区启动分化，并在次级淋巴器官的生发中心（GC）内完全分化。在此，它们通过直接细胞接触和细胞因子（如IL-21）产生，为B细胞选择、抗体亲和力成熟及类别转换重组提供关键信号。

Tfh细胞的一个决定性特征是其显著的异质性，主要可从两个维度进行归类：空间分布和功能表型。基于解剖位置，Tfh细胞被划分为不同的亚群：位于GC内的GC-Tfh、位于滤泡套区（FM）的FM-Tfh、在外周血中巡逻的循环Tfh（cTfh）以及外周辅助T细胞（Tph）。此外，还有黏膜组织Tfh。它们共享辅助B细胞的功能，但在表型上存在差异。Tfh细胞表现出功能可塑性，产生共表达其他T辅助细胞谱系典型转录因子和细胞因子的亚群（例如，Tfh1中的T-bet（TBX21）/IFN-γ，Tfh2中的GATA3/IL-4，Tfh17中的RORγT（RORC）/IL-17），从而针对特定的免疫挑战定制抗体反应。

在包括感染、自身免疫性疾病和癌症在内的病理条件下，Tfh细胞及其相关细胞的丰度、亚群组成和功能常常出现显著扰动，突显了它们在疾病发病机制中的关键作用。然而，研究这些关系因这些细胞的动态和可塑性而变得复杂。本综述旨在整合当前对Tfh细胞异质性的理解，融合空间、表型和功能视角。我们将探讨经典Tfh亚群的发育途径、迁移动态和多样化角色，同时也会重点讨论Tph细胞以及黏膜免疫中Tfh/Tfh样细胞的新兴作用。

1.1 多阶段旅程：Tfh细胞的分化、迁移和成熟

Tfh细胞的分化是一个受到严格调控的多阶段过程，可大致划分为启动、迁移和效应阶段，最终在GC内实现功能特化。Tfh细胞命运在次级淋巴器官的T-B边界启动。在此，初始CD4⁺ T细胞从抗原呈递细胞（APC）（主要是树突状细胞（DC））接收关键信号，包括MHC-II复合物、共刺激分子和细胞因子信号。这种协同信号级联激活BCL6，从而定义了Tfh谱系。BCL6通过驱动经典Tfh标记物（如CXCR5）的表达并抑制促进替代性T辅助细胞命运的基因（例如T-bet/Th1、GATA3/Th2、RORγT/Th17）以及Tfh拮抗剂BLIMP1来协调Tfh的定向分化，使初始CD4⁺ T细胞极化为Tfh而非非Tfh T辅助细胞。其他转录因子，包括BATF、ASCL2、c-Maf，在BCL6上游或与其协同作用，以加强这一发育程序并促进IL-21的产生。

upon 上调CXCR5并下调T区归巢受体CCR7后，新定向的前体Tfh细胞（pre-Tfh）朝向CXCL13趋化因子梯度迁移进入滤泡，并成熟为GC-Tfh。pre-Tfh在GC内的初始定位受CXCR5、CCR7和EBI2信号平衡的调控。在GC内，与APC（特别是通过B细胞的ICOSL、CD40以及DC的CD115/CD112）的持续相互作用对于GC-Tfh细胞的最终成熟不可或缺。成熟的GC-Tfh细胞以高表达BCL6、CXCR5、PD-1和ICOS为特征，并且是高效的IL-21分泌者，这对于支持B细胞分化和抗体生产至关重要。通过下调CCR7并对CCL19/CCL21信号作出反应，pre-Tfh也可迁移进入FM成熟为FM-Tfh。

GC-Tfh可以形成一个过渡性的CXCR5⁺CCR7^loPD-1^hi迁移亚群，该亚群穿过被膜下窦进入输出淋巴管，向胸导管迁移，其表型与循环Tfh（cTfh）趋同，表现为CD69、CD90、Ki-67下调以及KLF2、S1PR1、S1PR2上调。此外，胸导管Tfh（TDL-Tfh）保留了GC-Tfh的转录和表观遗传印记，它们的TCR克隆型在外周cTfh中富集，证实了从GC-Tfh到TDL-Tfh再到cTfh的迁移路径和表型变异。cTfh和GC-Tfh之间的克隆重叠以及它们共享的表达BCL6和IL-21的特征进一步证明了这一点。

1.2 Tfr：生发中心动态的混合调节器

滤泡调节性T细胞（Tfr）是GC内一个关键的免疫调节亚群，共表达BCL6（与Tfh细胞共享）和FOXP3（Treg的特征），同时具有混合表型，结合了Tfh样表面标记（CXCR5⁺PD-1⁺ICOS⁺）和Treg样表面标记（CTLA-4⁺GITR⁺）。来源于胸腺Treg（CD25^hiCD38⁺）且TCR库与Treg更相似的Tfr被称为自然Tfr（nTfr），它们定位于GC套区/暗区，其有限的TCR多样性支持它们通过其对自身抗原的偏好性，借助抑制分子（如CTLA4）、神经突蛋白（阻止GC B细胞扩增）和诱饵受体IL-1R2/IL-1受体拮抗剂（阻止GC B细胞活化）来抑制自身反应性GC B细胞克隆。

除了直接靶向B细胞，Tfr还调节GC微环境以防止过度的免疫反应。初始T细胞进入GC的时机影响其分化：早期到达的前体细胞暴露于强烈的TCR和共刺激信号，倾向于采用Tfh表型；而晚期到达的细胞——遇到抗原可用性下降、IL-6/IL-21减少以及抑制性信号（如CTLA-4、IL-10）增强——优先分化为Tfr，这被称为诱导性Tfr（iTfr），被认为起源于CD25^hi Tfh前体，受IL-2信号和GC微环境线索的影响。它们主要作用于生发中心明区，通过抑制过度的Tfh反应来调节GC收缩，同时为亲和力成熟的GC-B提供帮助（例如通过分泌IL-21和IL-10）以维持其在暗区微环境中的存活，同时抑制其活化。此外，“晚期Tfr”是iTfr的一个亚群，它进入GC较晚，通过长时间的相互作用（可能通过FasL信号）诱导GC B细胞凋亡。它介导GC终止，也可被视为免疫抑制。因此，可以假设Tfr细胞的功能极化受其发育上接近Tfh或Treg谱系的影响，这意味着从Treg或Tfh向Tfr的转变可能代表了由细胞起源和微环境线索共同塑造的功能和表型连续体。

系统性免疫监视涉及循环Tfr（cTfr，BCL6⁺CXCR5⁺CD4⁺FOXP3⁺CD25⁺），它们被假设通过S1P和CXCR5-CXCL13轴在血液和淋巴组织之间巡逻，并归巢到新生的GC以启动调节网络。这个亚群被认为是“不成熟Tfr”：它表现出降低的免疫抑制能力，并可能加速次级抗体反应；其BCL6和Tfh样表面标记的表达低于Tfh，同时保持与Treg相似的FOXP3表达，且抑制功能低于GC-Tfr。抗PD-1治疗可增加cTfr，从而增加浆母细胞数量和免疫球蛋白滴度，这两者均与CD38⁺ cTfr（可能被视为“i-cTfr”亚群）呈正线性相关，表明其功能偏离了传统的Tfr功能。

总之，Tfh生物学受多层控制：转录对抗（BCL6 vs. BLIMP1）、由时空分子浓度梯度引导的细胞定位，以及与Tfr的功能交叉对话。定义这些亚群需要整合表型标记、功能输出和解剖背景，以解析它们在免疫和自身免疫中的作用。

2 经典Tfh细胞的异质性：GC-Tfh、FM-Tfh、cTfh

如引言所述，Tfh异质性由空间和表型标准定义。本节将详细阐述经典空间亚群的特征：GC-Tfh、FM-Tfh和cTfh。

2.1 生发中心Tfh

GC-Tfh细胞以高表达BCL6、PD-1、CXCR5以及CD44^hiCD62L^loCD90^loCCR7^loPSGL1^loCXCR5^hiICOS^hiPD-1^hi的特征谱为标志。它们并非单一群体，而是表现出显著的功能可塑性，由不同的细胞因子环境和转录程序驱动，这些程序赋予了它们T辅助细胞谱系样特征（Tfh1、Tfh2、Tfh17）。这种异质性得到了原位多重免疫荧光和CyTOF分析的经验支持。

2.1.1 GC-Tfh的分布特异性及谱系亚群特征

GC-Tfh细胞的丰度和活化状态在不同次级淋巴器官间差异显著，反映了它们各自独特的免疫学角色。流式细胞术显示Tfh频率呈扁桃体 > 肠系膜淋巴结（mLN）> 脾脏的梯度，而活化标记（如Ki-67、CXCR5、PD-1、ICOS、HLA-DR、CD38）的表达则呈扁桃体 > 脾脏 > mLN的梯度。Tfr群体在标记物表达上复制了这种活化梯度（扁桃体 > 脾脏 > mLN），但表现出相反的频率分布模式，即在mLN中比在扁桃体或脾脏中更富集。这表明扁桃体是活跃的反应中心，脾脏是储存场所，而mLN可能作为受调控的转运枢纽，这与它们在抗原运输中的作用一致。尽管存在这些数量差异，但Tfh谱系亚群偏斜的定性特性和定义特征在这些部位具有可比性，允许进行通用的亚群分类。

GC-Tfh的偏斜高度依赖于环境。在稳态下，它表现出有限的异质性和相似的转录谱。然而，在疾病扰动期间，APC（主要是DC）和细胞因子环境有效地重塑GC-Tfh的极化，促使与其他Th谱系相关的转录因子表达并分泌相关的细胞因子，从而针对特定的免疫挑战定制抗体反应。它们的分化由抗原呈递细胞（APC，主要是树突状细胞（DC））的特定线索启动，这些线索塑造了随后的极化。主要亚群的特征总结见表格。

除了这些主要亚群，GC-Tfh中也存在调节性亚群，包括Tfh10和细胞毒性Tfh。Tfh10与常规Tfh共享特征，但产生高水平的IL-10，同时缺乏Foxp3和CD25，从而与Tfr区分开来。它们感知炎症（例如通过IL-6）并通过IL-10反馈以建立抗炎平衡。细胞毒性Tfh细胞高且特异性地表达GZMK和GZMA，以及GZMB。它们可以杀死GC B细胞以抑制高亲和力抗体的产生或清除受感染细胞，但如果过度活化也可能破坏GC稳态。它们与Tfh1亚群关系更密切，并在慢性炎症和纤维化疾病中发挥作用。

2.1.2 GC-Tfh亚型分型中的问题

传统上，Tfh亚群通过细胞因子谱或转录因子进行分类，但两种方法都存在局限性。细胞因子和转录因子存在错位。已证明GC-Tfh2依赖于c-Maf和CNS2而非GATA3（其在Tfh2中表达低）；IL-5/IL-13的产生严格依赖于GATA3，而IL-4⁺ Tfh本身并不共表达IL-5或IL-13。此外，有人认为IL-4的表达并不必然赋予GC-Tfh Th2偏向的异质性，然而在寄生虫模型中，这些IL-4⁺ Tfh确实促进了针对蠕虫的宿主IgE和IgG1反应。此外，更具Th2样的Tfh13亚群（产生IL-4/5/13且依赖GATA3）比仅产生IL-4的细胞更能胜任“真正的”GC-Tfh2。因此，通常所指的“IL-4⁺ GC-Tfh2”似乎不是一个精确的分类，其异质性值得专门研究。类似地，GC-Tfh17中IL-17的产生并不严格依赖RORγT，而是ICOS依赖性的。在缺乏RORγT的情况下，IL-6/IL-23信号可以激活STAT3，后者与IRF4/BATF协作结合IL-17A启动子，从而维持IL-17A的产生，表明GC-Tfh17的产生是一个由多个转录因子和细胞因子协调的过程。因此，细胞因子和转录因子特征常常错位，强调需要一个更精确和动态的分类系统。

用于cTfh的基于表面标记（例如CXCR3/CCR6）的分类方法也无法完全与细胞因子/转录因子亚群对齐，表明在GC-Tfh和cTfh中定义的亚群可能不完全类似。使用CXCR3/CCR6标记和细胞因子（IFN-γ、IL-17）的同时分析发现，一些通过表面标记（CXCR3/CCR6）识别的GC-Tfh亚群（例如Tfh1和Tfh17）并未共表达IL-21及其相应的细胞因子，但随着相应环境刺激的增加，标记识别的GC-Tfh1/GC-Tfh17中这种“错位”的细胞比例减少，表明“对齐”的GC-Tfh可能被视为一种活化状态。有趣的是，确实存在同时产生IL-17、IL-21和IFN-γ的Tfh1/17细胞（CXCR3⁺CCR6⁺），尽管它们在CXCR3⁺CCR6⁺CXCR5⁺亚群中很罕见，其中IL-17/IFN-γ单表达亚群占主导。单细胞RNA测序也揭示了特定环境下的交叉极化：在Tfh1富集条件下约8%的Tfh表现出Tfh2特征，而在Tfh2条件下约15%的Tfh显示出Tfh1特征。这些发现表明，表面标记和细胞因子的错位可能也很大程度上源于环境刺激及其相应状态的影响，而非某些标记的不准确性。

2.2 滤泡套区Tfh不同于前体Tfh和GC-Tfh

滤泡套区（FM）是围绕GC的区域，位于GC和滤泡被膜之间。它富含IgD⁺ 初始B细胞，因此可以通过CD157或CD21（两者在GC中阳性）和IgD（在FM中阳性）标记与GC区分。基于IgD⁺ 初始B细胞富集和Tfh迁移速度梯度（FM中迁移速度较低）的技术，测得FM区的跨度约为50 μm。FM-Tfh指一个空间定义的功能亚群，稳定占据FM并通过被膜下窦（SCS）巨噬细胞扫描抗原，同时其表面分子特征CXCR5、PD-1和ICOS的表达与它们的GC对应物（GC-Tfh）共享但略低。

大约30%的FM-Tfh细胞直接从pre-Tfh分化而来，未经过GCs，表明存在一条不依赖GC的发育途径。这一过程通过BCL6介导的对PSGL1、EBI2和S1PR1基因的调控来协调，这破坏了GC和FM之间Tfh交换的屏障，相应地，FM-Tfh和GC-Tfh之间可以发生转化，因此FM-Tfh是GC-Tfh的来源之一。

然而，尽管存在这种交换，FM-Tfh呈现不同的分子谱，在静息状态下塑造了其与GC-Tfh不同的功能：虽然表达与GC-Tfh相当的Bcl6转录本水平，但它们表现出显著降低的BCL6蛋白表达（约减少60%），这源于IL-9受体（IL-9R）信号维持基线BCL6表达，IL-9剥夺后BCL6进一步下调证明了这一点，表明它们的低极化状态。细胞因子分泌谱显示与GC-Tfh相比，IL-10产量升高但IL-4输出减少。IL-10分泌抑制记忆B细胞凋亡，补充了GC-Tfh驱动的增殖，这两者对于记忆池的维持都至关重要。在诸如LCMV感染的扰动下，FM-Tfh可以表达T-bet和IFN-γ，获得Th1样效应功能，其中STAT3也至关重要。这种可塑性由持续的IL-9R表达促进，使其能够对通过B细胞衍生的白三烯LTC4激活的ILC2分泌的IL-9作出反应。关键的是，中间水平的KLF2表达梯度决定了FM-Tfh的空间特异性，并使它们易受穿孔素依赖性NK细胞清除的影响，而IL-9信号也能抵消这种清除，表明IL-9可能是FM-Tfh发育和调控中不可或缺的因素。

FM-Tfh的转录重编程在再攻击时类似于GC-Tfh谱，将抗体产生速率比初次反应加速五倍。FM-Tfh从CD169⁺ 巨噬细胞获取抗原，这使得能够有效地呈递给记忆B细胞，重新激活次级GC反应。因此，FM-Tfh可能是一个多功能亚群，协调先天免疫与GC/滤泡外（EF）反应之间的相互作用，在稳态下维持免疫稳定性，并在再次遇到抗原时发动快速反应。

在病理上，FM-Tfh引起过敏但避免自身免疫反应，并呈现年龄相关性。受滤泡套区B细胞中缺乏体细胞高频突变（SHM）的限制，FM-Tfh只能诱导IgE⁺ B细胞，而不会产生自身反应性IgE抗体，并最终诱导低亲和力IgE，这在过敏中起作用，因为它们能快速产生抗体和反应，例如，IL-9R⁺ FM-Tfh驱动屋尘螨（HDM）特异性IgE增加五倍，而阻断IL-9R能显著改善过敏反应。相反，由于GC-Tfh经历SHM，可以诱导高亲和力抗体，例如，GC-Tfh13能够诱导B细胞分化为产生高亲和力IgE的浆细胞。FM-Tfh的积累（增加40%）和GC-Tfh的逐渐减少都与年龄和受损的GC反应相关，解释了老年人群疫苗效力降低的原因。因此，可以推断，通过靶向KLF2-S1PR1或IL-9R信号来重新校准FM-Tfh/GC-Tfh平衡，可能为过敏性疾病和年龄相关性免疫衰退提供一种新的干预措施。

由于解剖困难（由于定位和与GC-Tfh的表型重叠）以及其病理作用不如GC-Tfh和cTfh显著，FM-Tfh很少被研究，但研究它可能有助于深入了解GC-Tfh和cTfh之间的潜在关系。实时可视化pre-Tfh、FM-Tfh和GC-Tfh的运输对于直接观察它们的关系很重要；研究KLF2和IL-9R的交叉对话（包括KLF2是否直接抑制Il9r转录以调节FM-Tfh扩增）以及KLF2^int IL-9R⁺ 共表达在人类淋巴结与扁桃体中的一致性，可以进一步解码FM-Tfh的发育，并加深对其在Tfh可塑性中作用的认识。

2.3 循环滤泡辅助性T细胞

循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）以表面标记CXCR5⁺CD45RA^?CD45RO⁺为特征。虽然被认为起源于GC-Tfh，但cTfh表现出BCL6表达降低，同时CCR7水平升高，CXCR5表达适度下降。它们的功能改变与表型调控和空间定位相关。除了作为长寿命记忆池外，cTfh在再刺激下被激活并经历克隆扩增，以刺激B细胞分化产生抗体。它们在抗病毒中和抗体产生中发挥重要作用，而cTfh的异常增加与自身免疫相关。它们通过T-B相互作用促进初始和记忆B细胞分化为分泌IgG、IgE和IgA的浆母细胞，主要依赖于它们分泌的IL-21。这个过程是抗原特异性的，数量和效应功能存在差异。例如，在流感、破伤风或白念珠菌疫苗接种后，MHC-II肽段四聚体技术可以分离出针对每种抗原的特异性cTfh。有趣的是，cTfh细胞在帮助B细胞方面比淋巴结中的效应Tfh细胞更有效：它们可以被DC重新激活，归巢到GCs，并产生更多细胞因子，这与其记忆功能和在刺激下的再激活相一致。

2.3.1 具有记忆表型的循环Tfh

cTfh有四种发育状态：初始（Tn）、干细胞样记忆（Tscm）、中央记忆（Tcm）和效应记忆（Tem）。最终，cTfh主要呈现Tem或Tcm表型。在最初产生时，cTfh呈现Tem表型（低CCR7），与GC-Tfh一致，随后在抗原刺激后逐渐转变为Tcm状态（高CCR7），成为稳态条件下相对稳定的主要记忆亚群，它采用更“干细胞样”的表型，包括内在表达介导迁移的CCR7和CD62L，以及比cTfh-Tem中更低的Tfh谱系亚群转录因子和细胞因子表达，而Tfh-Tem频率较低，并在特定疾病下异常扩增，可能是由于在相应环境中的主导效应。cTfh记忆状态活性的程度由CCR7（干细胞样标记）、ICOS和PD-1（活化标记）决定。PD-1⁺⁺CCR7^lo 细胞在再次遇到抗原时迅速分化为成熟Tfh。其中，ICOS⁺PD-1⁺⁺CCR7^lo 细胞（占cTfh的<1%）表达Ki-67，代表活化的记忆cTfh，而ICOS^?PD-1⁺CCR7^int 和ICOS^?PD-1^?CCR7^hi 亚群对应于静息记忆cTfh。向活化Tem表型的转变具有临床意义；例如，RA患者表现出Tfh-Tem（PD-1^hiCCR7^lo/ICOS⁺PD-1^hiCCR7^lo）频率增加，这与疾病活动性相关，表明是抗原驱动的活化。因此，获得活化的Tem表型（以PD-1^hiCCR7^lo为特征）使cTfh在表型和功能上都更接近GC-Tfh，表明cTfh因其记忆状态的转变而变得活跃。

2.3.2 cTfh的异质性

血液中的cTfh根据表面趋化因子受体（类似于Th谱系）分为三个功能亚群：cTfh1（CXCR3⁺CCR6^-）、cTfh17（CXCR3^-CCR6⁺）和cTfh2（CXCR3^-CCR6^-）。一个罕见的cTfh1–17亚群（CXCR5⁺CXCR3⁺CCR6⁺）也被发现并与B细胞反应有关，尽管其稀少性限制了机制上的深入了解。cTfh2分泌IL-4、IL-5和IL-13，但不分泌IL-6或IL-10，通过缺乏抗炎功能与Th2细胞区分开来。cTfh1分泌IFN-γ并表达T-bet，而cTfh17分泌IL-17A和IL-22并表达RORγT，分别类似于Th1和Th17谱型。

在病毒感染期间，cTfh1扩增并通过帮助记忆——而非初始——B细胞来促进病毒特异性IgG产生，强调了一种特定的辅助表型。病原体相关DNA诱导的cTfh刺激进一步诱导IFN-γ⁺ cTfh，加强了它们在抗病毒免疫中的作用。cTfh1也表现出致病潜力：它们提供CD40L、IFN-γ和IL-21以促进CD21^loT-bet^hi B细胞，其中CD40激活胜过TLR信号。CXCR3介导cTfh1迁移到炎症部位，例如多发性硬化症中的脑脊液，在那里它们显示出细胞毒性基因特征。Tfh1见于狼疮性肾炎的肾脏和IgA血管炎的肠道，其在外周血中的cTfh1减少提示了组织归巢。

cTfh17可以产生IL-21并帮助初始B细胞。它们与自身免疫密切相关：约60%的自身反应性cTfh为IL-17阳性，并独家表达RORγT，以RORγT依赖的方式驱动记忆B细胞诱导特异性自身抗体，因此在质和量上都与自身免疫病相关。此外，除了辅助功能，cTfh17细胞在血清中也呈现扩增，并浸润靶组织，如IgAV肾炎的肾脏和大动脉炎（Takayasu arteritis）的主动脉。然而，CCR6并非Tfh17特异性，且BCL6本身可以抑制CCR6表达，使亚群识别复杂化。

cTfh2也产生IL-21，但其具体功能仍不清楚。其定义标记（CXCR3^-CCR6^-）是阴性的，而先前假定的关键细胞因子IL-4对cTfh2并不特异。通过CXCR3和CCR6双阴性分类包含了大量不表达GATA-3/不表达IL-4的细胞，表明CXCR3/CCR6双阴性并不能完全表征cTfh2。一些研究已开始使用CXCR3^-