烟草野火病菌株Pta 6605通过逃逸植物免疫系统在烟草中诱导系统性萎黄症

《Journal of General Plant Pathology》：Comparative analysis of interactions between five strains of Pseudomonas syringae pv. tabaci and Nicotiana benthamiana

本研究旨在解决烟草野火病病原菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci, Pta）不同菌株与寄主植物互作机制不清的问题。研究人员通过比较5株Pta菌株在烟草（Nicotiana benthamiana）中的致病性及植物免疫反应，发现Pta 6605菌株毒力最强，其通过抑制水杨酸（SA）和乙烯（ET）生物合成基因的表达，逃逸植物免疫系统，并诱导了系统性萎黄症。该研究为解析Pta的高毒力机制及植物抗病基因功能研究提供了重要模型。

　　

在植物与病原菌的漫长战争中，植物进化出了精密的免疫系统来抵御入侵者。这套系统主要分为两个层次：由病原相关分子模式（PAMP）触发的模式触发免疫（PTI）和由效应蛋白触发的效应蛋白触发免疫（ETI）。然而，狡猾的病原菌，如丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），会分泌效应蛋白来抑制PTI，从而建立感染。烟草野火病病原菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci, Pta）是典型的半活体营养型病原菌，其模式菌株Pta 6605已被广泛用于研究其毒力机制。然而，寄主植物中决定对Pta抗性或感病性的基因仍然知之甚少。

本氏烟草（Nicotiana benthamiana）作为茄科的模式植物，是进行基因功能分析的理想材料。Pta 6605能够感染本氏烟草并引起严重的病害症状，因此可用于研究寄主对Pta的感病机制。但若要研究寄主对Pta的抗性机制，则需要能够被本氏烟草识别并激活寄主防御反应的不亲和或低毒力菌株。为了填补这一空白，研究人员在本研究中比较了5株分离自日本的Pta菌株（6605、6823、7272、7375和7380）在本氏烟草上的毒力及其诱导的寄主反应，旨在筛选出高毒力和低毒力的代表性菌株，为后续研究寄主抗病或感病机制奠定基础。

主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   体外表型分析：在液体和固体培养基中比较了5株Pta菌株的生长曲线、群集运动（swarming）和游动运动（swimming）能力。
2. 2.
   植物互作分析：将不同浓度的Pta菌株接种到本氏烟草叶片中，观察病害症状，并测定叶片内细菌的种群数量。
3. 3.
   植物激素检测：通过液相色谱等方法，定量分析了接种Pta菌株后本氏烟草叶片中水杨酸（SA）的积累水平。
4. 4.
   基因表达分析：利用RT-qPCR技术，检测了接种Pta菌株后本氏烟草叶片中SA、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）生物合成相关基因的转录水平。

研究结果

1. 五株Pta菌株的体外表型特征

研究人员首先在体外比较了五株Pta菌株的生长和运动能力。结果显示，在液体培养基中，所有菌株在生长初期表现相似，但在生长后期，菌株的细胞密度出现分化。Pta 6605和Pta 6823的细胞密度最高，约为生长最慢菌株（Pta 7375和Pta 7380）的1.5倍，而Pta 7372的生长水平介于两者之间。在运动能力方面，Pta 6605表现出比其他四株菌株更活跃的群集运动能力。而在游动运动方面，除Pta 7375外，所有菌株均表现出活跃的游动能力。

2. Pta菌株与本氏烟草的互作

为了评估菌株的毒力，研究人员将Pta菌株接种到本氏烟草叶片中。在高浓度接种时，所有菌株均能良好生长，其中Pta 6605增殖最多，Pta 7375增殖最少。在低浓度接种时，Pta 6605和Pta 6823的增殖能力最强，其种群数量比Pta 7380高出约5个数量级。Pta 7372的生长水平介于Pta 6605/Pta 6823和Pta 7380之间。病害症状观察发现，Pta 6605和Pta 6823引起的萎黄症比其它菌株更严重。

3. Pta接种诱导植物激素生物合成基因的表达

为了探究寄主对Pta菌株的防御反应，研究人员检测了植物激素的积累和基因表达。结果显示，Pta 6823和Pta 7372的接种明显诱导了水杨酸（SA）的积累，而Pta 6605的接种则未诱导SA积累。在基因表达水平上，Pta 6823和Pta 7372显著诱导了HR标记基因HSR203J的表达，但抑制了异分支酸合酶（ICS）的表达。此外，Pta 6823和Pta 7372还诱导了乙烯生物合成基因（ACS和ACO）的表达。相反，Pta 6605不仅未诱导SA和乙烯生物合成基因的表达，反而抑制了茉莉酸（JA）生物合成基因（AOS和AOC）的表达。

4. Pta 6605诱导未接种的上部叶片萎黄症

研究人员进一步观察了局部接种Pta菌株对植物后续生长的影响。结果发现，在接种了Pta 6605的植物中，未接种的上部叶片出现了明显的萎黄症。尽管Pta 6605具有极强的运动能力，但研究人员并未从出现萎黄症的上部叶片中分离到Pta 6605，这表明Pta 6605可能并未移动到上部叶片，而是通过某种信号诱导了系统性萎黄症。

结论与讨论

本研究通过比较五株Pta菌株与本氏烟草的互作，揭示了Pta 6605是其中毒力最强的菌株。Pta 6605不仅能在接种叶片中引起严重的病害症状并大量增殖，还能诱导未接种的上部叶片出现系统性萎黄症。与Pta 6605类似，Pta 6823也能引起严重的病害症状和萎黄症，但其并未诱导系统性萎黄症。Pta 7375和Pta 7380则是毒力最弱的菌株。

Pta 6605的高毒力可能与其体外生长和运动特性有关。Pta 6605在高细胞密度下生长更活跃，且具有极强的群集运动能力，这些特性可能有助于其在植物体内定殖和扩散。更重要的是，Pta 6605似乎能够逃逸或抑制本氏烟草的免疫系统。与诱导SA和乙烯生物合成的Pta 6823和Pta 7372不同，Pta 6605的接种既不诱导SA积累和乙烯生物合成基因的表达，反而抑制了JA生物合成基因的表达。这种对植物免疫系统的抑制可能是其高毒力的关键原因。

关于Pta 6605诱导系统性萎黄症的机制，研究人员推测，Pta 6605可能并未移动到上部叶片，而是通过分泌某种毒素或信号分子来诱导萎黄症。虽然Pta 6605已知产生引起萎黄症的毒素tabtoxin，但目前尚无证据表明tabtoxin能引起系统性萎黄症。因此，Pta 6605可能产生类似phaseolotoxin或tagetitoxin的毒素，这些毒素能够抑制植物精氨酸生物合成或叶绿体RNA聚合酶活性，从而引起系统性萎黄症。

综上所述，本研究筛选出了Pta 6605作为研究寄主感病机制的高毒力菌株，并揭示了其通过逃逸植物免疫系统实现高毒力的特性。Pta 6605诱导的系统性萎黄症为研究病原菌如何远程操控寄主植物提供了新的模型。未来，通过比较Pta 6605与低毒力菌株（如Pta 7380）的效应蛋白库，以及利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默寄主防御相关基因，将有助于揭示Pta 6605高毒力的分子机制和寄主抗病/感病的关键基因。