CPOP1介导血红素合成调控百脉根根瘤微氧环境与共生固氮的关键机制

《Journal of Integrative Plant Biology》：CPOP1 is a key enzyme required for nodule microenvironment control and successful symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus

本研究揭示了百脉根（Lotus japonicus）中类粪卟啉原III氧化酶（CPOP1）通过调控宿主血红素合成，维持根瘤感染细胞微氧环境，激活根瘤菌固氮基因表达并促进细菌增殖的关键作用。CPOP1缺失导致根瘤氧水平升高、固氮酶活性下降，表明其在共生固氮微环境调控中具有不可替代的功能。

　　

CPOP1编码一种根瘤特异性表达的血红素合成酶

为探究血红素在共生固氮中的作用，研究者首先分析了血红素合成酶的表达模式与进化关系。百脉根基因组中存在两个_CPOP基因和一个_CPOM基因。在线基因表达图谱显示，CPOP1在根瘤中特异性高表达，而其同源基因CPOP2和CPOM在叶片中表达较高。系统发育分析表明，_CPOP和_CPOM在豆科和非豆科植物中广泛存在，但拷贝数存在种间差异。_CPOP家族在进化早期起源，在动物、植物和原核生物中催化区高度保守，植物和动物的_CPOP主要区别在于N端转运肽：植物具有质体转运肽，动物则具有线粒体转运肽。

进一步分析表明，CPOP1转录本在根瘤成熟过程中积累，在接种后10天（DPI）达到峰值，随后在衰老根瘤中逐渐减少。与CPOP1在固氮活跃根瘤中的高表达不同，CPOP2和CPOM在根瘤各阶段表达水平较低，而在叶片中表达较高。因此，CPOP1是百脉根血红素合成基因中唯一在固氮根瘤中特异性高表达的成员。

CPOP1敲除导致血红素匮乏与共生固氮能力显著下降

为确定_CPOs在根瘤中的定位，研究者通过根瘤瞬时转化实验发现，_CPOP1和_CPOP2在根瘤固氮区表达，而不在根瘤皮层、根或未感染根瘤原基中表达。_CPOP1特异性定位于感染细胞（ICs），而_CPOP2同时定位于感染细胞和未感染细胞（UCs）。拟南芥和大豆的_CPOP定位于质体，具有类似质体转运肽的_CPOP1和_CPOP2定位于根瘤细胞的推定质体中。相比之下，_CPOM定位范围更广，包括根瘤的感染细胞、未感染细胞和皮层细胞，且与线粒体标记共定位。

通过_LORE1插入缺失突变体分析，发现cpop1、cpop2和cpom单突变体在1/2 MS培养基上均表现子叶黄化，表明突变体子叶中存在叶绿素合成缺陷。成年植株在氮限制培养基上生长时，cpop1表现出叶片黄化、花青素积累和矮化表型。野生型根瘤感染区因Lb的血红素铁卟啉基团而呈深红色，而cpop1突变体发育出白色的成熟根瘤，表明其固氮失败。外源硝酸钾可完全挽救cpop1在氮限制条件下的生长表型，证实其发育缺陷源于固氮受损。四个额外等位基因分析进一步表明，固氮缺陷特异源于CPOP1 disruption。与野生型相比，cpop1的地上部和地下部鲜重、根瘤数量和鲜重均减少。定量分析表明，cpop1根瘤总血红素含量和叶片叶绿素含量显著降低。总之，_CPOP1通过宿主控制的根瘤血红素合成在百脉根共生固氮中发挥重要作用。

CPOP2和CPOM主要参与营养和生殖发育

与cpop1不同，cpop2、cpom单突变及cpop2 cpom双突变幼苗在氮限制生长条件下产生红色根瘤和正常绿色叶片，表明根瘤血红素合成和固氮未受影响。然而，cpop2、cpom单突变或双突变体表现出生长抑制，表现为矮化幼苗和较小器官。cpop2的地上部和地下部生物量减少，根瘤数量减少。尽管cpop2的血红素含量与野生型相当，但每克根瘤的固氮速率降低，每植株的固氮速率显著降低，主要源于根瘤数量减少。外源氮耗竭下，cpop2的根瘤发育和结构、感染区大小和感染细胞大小与野生型同期相比均正常，但感染细胞中线粒体和质体异常增大。另一方面，cpom具有较短长角果和显著降低的结实率，表明线粒体定位的_CPOM参与生殖发育。未能获得cpop1 cpop2双突变体和cpop1 cpop2 cpom三突变体，推测可能致死。因此，_CPOP1而非_CPOP2或_CPOM是共生固氮期间血红素合成的关键组分。

CPOP1基因敲除提高根瘤内自由氧水平并降低根瘤菌固氮相关基因表达

由于含血红素蛋白如Lb、Glb和细胞色素参与细胞氧化还原调控，研究者采用氧微传感器检测野生型和cpop1根瘤的自由氧水平。野生型根瘤的氧微剖面在皮层区域急剧下降，在感染区域降至检测阈值以下。相比之下，cpop1的自由氧水平曲线下降较慢，且感染区外缘氧水平保持正值。统计分析表明，cpop1根瘤的微氧区域显著小于野生型。

为阐明根瘤氧水平如何影响cpop1固氮，研究者分析了氧敏感固氮酶基因的表达。百脉根根瘤菌中的_NifA2（固氮特异性转录激活因子2）在共生固氮期间作为转录激活因子，其表达受氧调控。NifA2基因及其下游NifA1（固氮特异性转录激活因子1）的表达在cpop1根瘤中均下调，可能源于氧水平升高。 consequently，cpop1的固氮速率显著低于野生型。 Western blot分析显示，结节特异性Lb水平在cpop1中显著降低，而根瘤菌_NifH（固氮酶铁蛋白亚基）丰度在两种基因型中相似，表明cpop1血红素缺陷可能 destabilize Lb，导致其快速周转，而_NifH不依赖血红素，不受影响。

总之，cpop1根瘤血红素生产受损可能干扰根瘤感染区严格控制的微氧环境，并降低根瘤菌中氧不稳定NifA基因的表达。CPOP1突变后固氮酶活性显著降低，表明其是共生固氮中的关键调控因子。

CPOP1正向参与共生体中的根瘤菌分裂

采用冷冻断裂扫描电镜（cryo-fracture SEM）观察根瘤内根瘤菌感染和分裂。百脉根定形根瘤源于外皮层细胞分裂，并在根瘤菌感染后数天保持活跃的侧生分生组织。野生型根瘤在7 DPI的感染细胞内可见侵染线（ITs）和大液泡。随着根瘤发育，感染细胞在10 DPI时充满通常含有单个根瘤菌的小共生体。随后侵染线逐渐降解，液泡收缩，为根瘤菌增殖提供空间。含有两个或多个固氮类菌体的共生体在14和21 DPI根瘤中占主导。

共聚焦明场图像支持cpop1根瘤感染区在不同发育阶段小于野生型，与cpop1根瘤尺寸减小一致。在cpop1根瘤中，侵染线延伸和细菌释放正常进行；然而，尽管感染细胞达到野生型尺寸，但它们容纳的共生体通常仅含单个类菌体，而野生型共生体在21 DPI时持有多个类菌体。监测野生型和cpop1感染细胞中共生体成熟过程发现，随着野生型根瘤发育，根瘤菌在共生体内分裂形成含多个根瘤菌的 enlarged成熟共生体。然而，在cpop1根瘤中，共生体的大小和形态随根瘤发育保持稳定。晚期（21 DPI）cpop1根瘤中，中央共生体大多含单个根瘤菌，而侧向共生体含多个根瘤菌，表明cpop1共生体内根瘤菌分裂受抑制。透射电镜（TEM）分析进一步证实了这一表型。定量分析表明，在14 DPI时，cpop1共生体在感染细胞外围和中央区域含有的根瘤菌数量均显著少于野生型。至21 DPI，尽管cpop1根瘤菌数量仍低于野生型，但外围区域部分恢复相对于中央区域。由于_CPOP1缺失，de novo血红素合成可能依赖在未感染细胞和感染细胞皮层区域作用的_CPOP2和_CPOM。研究者提出，这些外围位点产生的血红素，加上从未感染细胞向内扩散的血红素，可能形成向细胞中心递减的陡峭梯度。在此模型下，外围根瘤菌将获得充足血红素以支持细胞色素驱动的ATP生产和分裂，而中央根瘤菌可能低于所需阈值而停滞。与cpop1不同，cpop2、cpom单突变体和cpop2 cpom双突变体中根瘤菌分裂和共生体形态正常。总之，_CPOP1不仅参与固氮激活，还参与共生体内根瘤菌细胞分裂调控。

转录组分析揭示CPOP1调控共生固氮的核心通路

为更好理解cpop1共生体中根瘤菌分裂抑制机制，研究者通过定量PCR分析了10和21 DPI野生型和cpop1根瘤中细菌细胞分裂相关基因的表达水平。根瘤菌细胞周期调控基因CtrA（细胞周期转录调节因子A）、细胞分裂蛋白编码基因FtsZ和FtsH在10 DPI的cpop1根瘤中显著下调，而在21 DPI时表达无差异。其他基因如转录抑制子RepA（复制蛋白A）、细胞分裂调节因子MinC（小细胞位点C）、形态发生基因FliC（鞭毛蛋白C）和_FtsH蛋白酶活性调节因子HflK（高频溶原化K）在10 DPI的cpop1共生根瘤菌中也显著下调。

数据表明，21 DPI时野生型和cpop1之间差异或特异性表达的宿主基因数量远多于10 DPI。为进一步探究_CPOP1在共生固氮期间的潜在功能，研究者对21 DPI野生型和cpop1的差异表达基因进行了KEGG和GO富集分析。结果突出显示了KEGG富集通路，包括氨基酸生物合成、柠檬酸循环、嘌呤代谢、酮体合成与降解等，而GO富集分析展示了如有机氮化合物代谢过程、小分子代谢过程、嘌呤核糖核苷三磷酸结合等过程。总之，富集分析暗示_CPOP1可能参与有机氮代谢和氨基酸生物合成过程，表明cpop1中氮同受损。定量PCR表明，血红素合成途径组分CPOP1、GluTR1和血红素降解酶HO1在cpop1根瘤中的表达在10或21 DPI时均下调。研究者进一步分析了根瘤中血红素结合蛋白的表达水平，包括Lb、Glb、细胞色素P450、过氧化氢酶、过氧化物酶和亚硫酸盐还原酶（SUOX）。转录组数据显示，Lb和Glb基因的根瘤表达在血红素含量降低的cpop1中显著诱导而非抑制。另一方面，SUOX和过氧化氢酶的表达在cpop1根瘤中下调，表明_CPOP1可能在共生固氮期间参与一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）信号调控。

百脉根CPOP1特化的固氮功能依赖其启动子序列

为更好理解百脉根CPOP1的功能特异性，研究者进一步分析了仅有一个L. japonicus CPOP1同源基因的大豆CPOP基因。GmCPOP在成熟根瘤和根瘤原基中的表达水平高于叶片和根。在其天然启动子驱动下，_GmCPOP1-GFP主要在根瘤感染区积累，并局限于感染细胞的质体中，未感染皮层细胞质体中无检测信号。通过RNA干扰（RNAi）下调GmCPOP表达导致感染细胞中液泡增多和感染细胞/未感染细胞比率降低，这是一种指示类菌体增殖欠佳的细胞学模式，令人联想到百脉根cpop1表型。由于GmCPOP1功能完全缺失是幼苗致死的，研究者分析了EMS衍生的亚效等位基因Gmlmm2-1，该基因在一个保守催化残基携带Tyr-192 to Cys置换（以下简称gmcpop, _GmCPOP^Y192C）。gmcpop植株可存活，尽管小于野生型，且产生的根瘤保持固氮能力。总之，除根瘤菌装载功能外，单拷贝GmCPOP表现出比百脉根_CPOP1更多元的功能。

为定位CPOP1启动子中共生的核心调控元件，研究者在转基因根瘤中进行了启动子截断分析。结果表明，含有?881 bp区域或（?881至?740 bp）+ mini-35S融合的启动子构建体驱动GFP荧光特异性在感染细胞中表达，表明CPOP1启动子的?881至?740 bp区域对感染细胞特异性转录活性至关重要。研究者通过启动子交换实验评估了_CPOPs表达差异调控的功能相关性。百脉根CPOP1启动子驱动的CPOP1、CPOP2或AtCPOP足以恢复cpop1的共生表型，表明_CPOP启动子的进化分歧和_CPOP蛋白的功能保守。正如预期，_GFP标记的_CPOP2和_AtCPOP在CPOP1启动子驱动下，在感染细胞的质体样结构中积累——镜像天然_CPOP2的定位模式。

由于_CPOP蛋白在物种间保守，推测_CPOPs生物学功能分化主要依赖其差异表达模式和定位是合理的。研究者将百脉根CPOP1启动子与其近缘物种的启动子进行比对。有趣的是，具有感染细胞特异性顺式元件的?881至?740 bp启动子区域仅存在于LjCPOP1启动子中，而不存在于其他18个物种的启动子中，表明可能涉及新的进化事件。研究者将该启动子区域与重复序列数据库Repbase进行筛选，鉴定出一个来自Amblyraja radiata的高度相似转座子序列（长度=256 bp；相似性=0.6296），表明可能的水平序列转移。结果证明了百脉根CPOP1启动子共生固氮功能的进化获得。

总之，百脉根_CPOP1特异性定位于感染细胞，在宿主控制的共生血红素合成和根瘤感染区微氧环境维持中发挥重要作用。然而，其功能同源物_CPOP2和_CPOM不直接参与共生固氮调控。顺式元件作图和启动子交换实验表明，_CPOP1的功能分化与其启动子中?881至?740 bp序列的获得相关。