拟南芥根发育新机制：极性定位EXO70G1通过脂筏依赖的PIN2循环调控生长素运输

《Journal of Integrative Plant Biology》：Polar-localized EXO70G1 regulates root development in Arabidopsis thaliana

本研究首次发现拟南芥根细胞中EXO70G1蛋白在质膜（PM）呈现顶端-基部极性分布，作为外泌囊泡栓系复合体（exocyst）的关键亚基，通过建立空间标志位点促进生长素输出载体PIN2的循环效率。研究通过活细胞成像证实EXO70G1的极性建立早于PIN2且依赖于脂筏微域，双突变体exo70G1 exo70G2表现出根长缩短、生长素积累减少及PIN2膜定位缺陷，揭示了植物细胞极性建立的新型调控机制。

　　

EXO70G1 predominately localizes to the transverse PM domains of the root

研究团队通过构建pEXO70G1::EXO70G1-GFP融合蛋白，发现EXO70G1在根部分生组织所有细胞类型中均有表达，且与膜染料FM4-64共定位证实其定位于质膜。在表皮细胞中，EXO70G1-GFP在顶端和基部膜的信号密度显著高于侧膜，呈现点状聚集分布。质壁分离实验和Calcofluor White染色进一步验证了EXO70G1在质膜上的极性定位特征。共定位分析显示EXO70G1与高尔基体、内质网、TGN/早期内体等内膜标志物均无重叠，表明其向质膜的运输不依赖这些结构。

荧光漂白恢复实验揭示EXO70G1在顶端/基部膜的恢复速度（18.5秒）快于侧膜（25.7秒），且其动态行为不受BFA处理或细胞骨架抑制剂（LatB、oryzalin）影响，说明EXO70G1的膜靶向和极性定位具有BFA不敏感和细胞骨架非依赖性特征。与exocyst亚基SEC6/SEC8的共定位分析显示，虽然SEC6/SEC8主要富集于侧膜，但EXO70G1与它们在质膜上存在40%以上的共定位区域，且运动速度相似，支持EXO70G1作为exocyst复合体的功能组成部分。

EXO70G1 and EXO70G2 redundantly promote root growth

遗传分析表明exo70G1单突变体无明显表型，而exo70G1 exo70G2双突变体根长显著缩短，且该表型可被EXO70G1或EXO70G2的回补载体完全恢复。过表达EXO70G1株系根长增加，进一步证实其促根生长功能。细胞学分析发现双突变体分生区细胞长度和数量均减少，细胞分裂标志pCYCB1;1::GUS信号减弱，SCR表达下调，表明EXO70G1/G2通过调控细胞分裂影响根发育。

EXO70G1 co-localizes with PIN2 at the PM

共聚焦显微镜观察显示EXO70G1-tdTomato与PIN2-GFP在表皮细胞顶端/基部膜高度共定位，点状信号重叠明显。在皮层细胞基部膜也观察到类似共定位模式。Z轴扫描显示PIN2簇与EXO70G1信号在三维空间高度重叠。时间序列分析发现EXO70G1在胞质分裂早期即定位于细胞板，其极性建立早于PIN2，且在胞质分裂后持续维持，提示EXO70G1可能为PIN2的极性定位提供空间线索。

EXO70G1 and EXO70G2 function redundantly in regulating abundance of PIN2 at the PM

pDR5rev::GFP报告基因显示双突变体根尖生长素积累减少。PIN2-GFP在双突变体顶端膜荧光强度降低70%，簇密度下降，但侧膜信号无变化，导致极性指数改变。FRAP实验表明PIN2在双突变体中的恢复时间延迟，BFA洗脱实验显示PIN2从BFA区室向质膜的循环受阻，而内吞作用和液泡降解途径未受影响。分裂荧光素酶互补实验未检测到EXO70G1与PIN2直接互作，说明调控作用为间接方式。

The organization of lipid raft influences EXO70G1 abundance at the PM

水杨酸（SA）处理通过改变脂筏分布降低EXO70G1在质膜的丰度，同时抑制PIN2膜定位和根生长。而在exo70G1 exo70G2背景下，SA处理未引起PIN2的额外减少，说明EXO70G1的功能依赖脂筏微域。组成性循环蛋白GFP-PIP2;1在双突变体中的定位未受影响，且双突变体未出现pin2典型的向重力性缺陷，表明EXO70G1特异性调控PIN2而非通用膜蛋白运输。

EXO70G1-marked polar PM domains differ from other EXO70 isoforms

系统进化分析显示EXO70G1属于EXO70.3亚家族，其极性分布模式区别于侧膜富集的EXO70A1（EXO70.1亚家族）和均匀分布的EXO70B2（EXO70.2亚家族）。exo70G1突变导致EXO70A1向顶端/基部膜靶向减少，提示不同EXO70亚型间存在功能互作。EXO70G1的束状分布与PIN2簇相似，其调控机制可能涉及细胞壁-质膜连续体等细胞结构因素。

The EXO70 family is highly divergent and partially redundant

EXO70G2-GFP在质膜均匀分布伴胞质点状信号，与EXO70G1的极性定位形成互补。exo70A1 exo70G1 exo70G2三突变体根发育缺陷加剧，证实EXO70.1和EXO70.3亚家族间存在功能冗余。EXO70G1在细胞板的定位提示其可能参与胞质分裂，但exo70A1在此过程中起主导作用。外泌体亚基SEC15a/15b分别呈现极性/非极性分布，与EXO70亚型配对可能介导特异性货物运输。

Regulation of PIN2 by EXO70G1 depending on lipid raft organization at the PM

EXO70G1不参与PIN2在高尔基体/早期内体的分选或肌动蛋白依赖的囊泡运输，而是通过识别质膜磷脂酰肌醇等脂质成分，为PIN2循环提供空间位点标志。脂筏微域不仅通过直接结合招募PIN蛋白，还作为外泌囊泡栓系的识别平台。研究提出EXO70G1可能通过运输微域形成所需组分，间接指导PIN2向顶端/基部膜的靶向，而非直接介导其运输过程。