振动介导的辐照骨细胞功能恢复及其在乳腺癌骨转移中的调控作用

《Advanced Healthcare Materials》：Vibration-Mediated Recovery of Irradiated Osteocytes and Their Regulatory Role in Breast Cancer Bone Metastasis

本研究创新性地探索了低强度高频（LMHF）振动作为非侵入性机械干预手段，在减轻放疗所致骨损伤方面的潜力。研究聚焦于骨细胞（osteocytes），揭示了振动可通过调控Wnt信号通路，减轻辐照诱导的细胞凋亡、上调细胞骨架标记物，并恢复骨细胞抑制乳腺癌细胞外渗（extravasation）的功能。该研究为优化乳腺癌放疗策略、改善骨健康提供了新的机械生物学（mechanobiology）视角。

　　

振动介导的恢复辐照骨细胞及其在乳腺癌骨转移中的调控作用

引言

放射治疗（radiotherapy）是乳腺癌治疗的基石，但会无意中损伤骨骼，导致骨质流失和疼痛，目前尚无有效的治疗策略。与化学介导的放射防护（radioprotection）研究广泛不同，机械介导的放射防护仍未得到充分探索。考虑到其安全性和有效性，本研究探讨了低强度高频（low-magnitude, high-frequency, LMHF）振动作为一种非侵入性干预措施，保护受辐照骨骼的潜力，重点关注骨细胞——主要的机械传感器和调节器，其功能延伸至调节乳腺癌骨转移。

振动减轻辐照骨细胞的凋亡

使用Apopercentage染色比较了2、4和8 Gy照射对骨细胞的影响，发现8 Gy照射后2天，细胞凋亡（apoptosis）显著增加。单次1小时LMHF振动（0.3 g，60 Hz）降低了这种凋亡的增加。此外，照射诱导了DNA双链断裂，通过γH2AX标记的焦点显示。然而，振动并未显著改变照射诱导的DNA损伤。

通过RNA测序（RNA-seq）评估照射和振动对骨细胞基因表达的影响。多重组比较以照射组（R）为参照，共鉴定出559个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。聚焦于那些被振动部分逆转的照射诱导变化的基因，发现振动通过内在凋亡信号通路（intrinsic apoptotic signaling pathway）部分逆转了凋亡。基因集富集分析（GSEA）显示，振动下调了辐照骨细胞中的炎症反应。

振动上调辐照骨细胞中的F-肌动蛋白

肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）在骨细胞功能中起着至关重要的作用。通过鬼笔环肽（phalloidin）染色发现，8 Gy照射通过降低丝状肌动蛋白（F-actin）的表达破坏了肌动蛋白细胞骨架，减少了细胞分支，同时扩大了F-肌动蛋白标记的细胞面积。相比之下，振动略微增加了辐照骨细胞中的F-肌动蛋白表达。RNA-seq分析显示，照射对大多数肌动蛋白丝相关基因产生了抑制作用，其中一部分基因的表达变化在振动后出现部分逆转。GO分析表明，这些逆转的基因表达变化参与肌动蛋白丝组织和束组装。GSEA显示振动处理后活性氧（reactive oxygen species, ROS）通路有下调趋势。

振动上调辐照骨细胞中的核纤层蛋白

F-肌动蛋白与连接核骨架和细胞骨架（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton, LINC）复合物相互作用，该复合物连接到核内膜的核纤层蛋白（lamins）。核纤层蛋白A/C（lamin A/C）对于维持核完整性、促进DNA修复过程和提供核结构支持至关重要。免疫荧光染色显示，在非辐照骨细胞中，两次振动后核纤层蛋白A/C表达增加。8 Gy照射后，骨细胞显示核面积增大，形态不规则，核纤层蛋白A/C表达升高，而两次振动方案进一步放大了辐照骨细胞中的这种增加。

振动恢复辐照骨细胞对乳腺癌转移的调控

骨细胞是骨稳态的主要调节器，通过将RAW细胞培养在骨细胞条件培养基中，发现辐照骨细胞促进了非辐照RAW细胞向破骨细胞（osteoclasts）的分化。当对辐照骨细胞施加振动时，并未显著改变破骨细胞的总数，但减少了多核巨破骨细胞的形成。RNA-seq数据表明，振动部分逆转了照射诱导的骨细胞中骨发育和骨生长相关基因的下调。

除了骨维持作用，骨细胞还参与调节骨转移。利用具有3D水凝胶的微流体（microfluidic）装置模拟骨-癌微环境，研究乳腺癌侵袭（无HUVECs）和外渗（通过HUVEC屏障）。验证显示，HUVECs在接种后5小时内形成VE-钙粘蛋白（VE-cadherin）细胞间连接，并保持完整达96小时。先前的研究观察到，仅在存在骨细胞的情况下，振动处理才能减少乳腺癌侵袭和外渗。然而，辐照骨细胞抑制癌症转移的能力减弱，导致非辐照乳腺癌细胞的侵袭和外渗增加。值得注意的是，连续3天每天施加振动1小时，恢复了照射后骨细胞的调节功能，使癌症外渗减少了18%。

振动进一步减少照射后的乳腺癌转移

进一步研究了照射对微流体装置中所有细胞的影响。在没有骨细胞的情况下，照射减少了乳腺癌细胞的侵袭，而振动对癌症侵袭没有直接影响。此外，照射通过降低细胞-细胞接触部位的VE-钙粘蛋白水平破坏了HUVEC细胞间连接，这与HUVEC周长的减少相关。当将乳腺癌细胞接种到HUVEC屏障中时，照射导致癌症外渗总体减少，而振动没有显著影响。因此，在没有骨细胞的情况下，振动不直接影响乳腺癌侵袭或外渗。

在与骨细胞共培养时，照射减少了癌症侵袭和外渗距离。随后的振动处理倾向于进一步减少侵袭距离，并显著减少外渗距离。由于对癌细胞进行照射，一些侧通道未被侵袭。对侵袭和外渗百分比的量化显示，振动显著降低了照射后的侵袭百分比，并且也显示出减少外渗百分比的趋势。

骨细胞调控癌症的潜在机制

在骨细胞中各种肿瘤调节通路中，Wnt信号通路最为显著富集。仔细检查显示，照射下调了Wnt相关基因，而其中大约一半可以通过振动上调，从而部分逆转了照射诱导的抑制。基因概念网络进一步说明了被逆转的Wnt相关基因与GO术语之间的连通性。GSEA显示振动处理后Wnt信号通路呈正向富集趋势，表明振动部分重新激活了Wnt信号。

除了对肿瘤调节通路的影响，振动直接影响了辐照骨细胞中肿瘤相关基因的表达。RNA-seq分析显示，振动抵消了照射诱导的肿瘤促进基因Ccnd1和Hmga2的上调，这一发现通过定量聚合酶链反应（qPCR）得到证实。为了研究Wnt信号在肿瘤促进基因表达中的作用，使用CCT036477抑制了辐照骨细胞中的Wnt通路。Wnt抑制削弱了骨细胞对振动的反应，减弱了振动诱导的Ccnd1和Hmga2下调。

讨论

放疗在乳腺癌治疗中至关重要，但其疗效受到对骨骼（包括骨细胞）意外损伤的限制。本研究结果表明，LMHF振动减轻了辐照诱导的骨细胞凋亡，并缓解了F-肌动蛋白表达的丧失。使用微流体平台，证明振动通过Wnt信号通路恢复了骨细胞介导的乳腺癌外渗调节。值得注意的是，振动和照射的组合累积性地抑制了乳腺癌侵袭和外渗，突出了LMHF振动作为放疗辅助手段在减缓乳腺癌进展方面的治疗潜力。

照射剂量应根据患者个体情况和治疗目的进行调整。对于全乳放疗，患者通常接受40至50.4 Gy的大分割剂量，分15至28次进行，每次分割剂量范围为1.8至2.67 Gy。随着动物模型尺寸减小，剂量相应降低。在大鼠模型中，总剂量24 Gy，分3天以8 Gy/天给予，被认为相当于人体剂量48 Gy。当过渡到细胞模型时，研究人员通常使用2至10 Gy的单次剂量来研究照射对乳腺癌细胞、内皮细胞和骨细胞的影响。本研究中选择相对较高的细胞剂量8 Gy，旨在建立损伤基线，以评估振动的潜在“挽救”效应。

辐射暴露诱导炎症和氧化应激，导致ROS产生。过量的ROS最终导致凋亡和DNA损伤。与先前研究一致，发现照射诱导了骨细胞凋亡和DNA损伤。类似的 detrimental 效应在小鼠中也观察到。总剂量16 Gy的辐射，分两次8 Gy给予，显著增加了空骨陷窝的百分比，这是骨细胞死亡的指标。在相同剂量下，合作者观察到照射后骨髓细胞活力急性降低。虽然照射降低了骨细胞活力，但机械刺激已显示出减轻这种效应的潜力。在本研究中，LMHF振动通过Bcl2l11介导的内在凋亡途径减轻了照射引起的骨细胞凋亡。振动还下调了辐照骨细胞中的ROS通路和炎症反应。这些发现扩展了我们对机械干预作为放射防护措施的理解。有趣的是，先前的一项研究报告称，12小时的循环拉伸抑制了UV辐射诱导的DNA损伤。然而，振动并未显著影响伽马辐射诱导的DNA损伤。类似地，使用P7C3的化学方法也未能对辐照细胞中的DNA损伤提供放射防护。总之，振动提供针对凋亡的保护，但不针对DNA损伤，可能是由于其对不同细胞通路的影响，或者需要更长时间的振动处理才能实现对DNA损伤的保护效应。

照射不仅影响细胞活力，还影响细胞骨架完整性，这对于维持细胞形状、运动和分裂至关重要。在骨细胞中，细胞骨架在机械转导中也起着关键作用。在三种细胞骨架丝中，F-肌动蛋白主要位于骨细胞突起内，机械刺激主要在此处传递。近期的研究结果表明，振动倾向于增加骨细胞中的F-肌动蛋白表达，进一步突出了其在骨细胞机械转导中的重要性。不幸的是，先前的研究表明，照射减少了MLO-Y4骨细胞和原代骨细胞中的树突长度。类似地，观察到辐照骨细胞中F-肌动蛋白表达减少、细胞分支减少、细胞面积增大以及核面积增大且形态不规则。值得注意的是，振动仅略微上调了辐照骨细胞中的F-肌动蛋白表达。可能是当前的振动设置和时间线足以观察到F-肌动蛋白表达的变化，但不足以揭示细胞形态或核特征的改变。或者，由于骨细胞具有调整和恢复其结构和功能的适应能力，最有效的时间点和振动参数仍有待确定。

细胞质中的F-肌动蛋白通过LINC复合物与核内膜的核纤层蛋白结合。虽然F-肌动蛋白和核纤层蛋白是相连的，但照射对它们的影响不同。观察到辐照骨细胞中F-肌动蛋白表达减少，但核纤层蛋白A/C表达增加。这一观察结果与一项研究一致，该研究表明照射后24小时，上皮细胞和乳腺癌细胞中核纤层蛋白A/C表达增加。有趣的是，到72小时时，上皮细胞的这种反应被逆转。因此，照射对核纤层蛋白A/C表达的影响是时间和细胞类型依赖性的。核纤层蛋白A/C是一种中间丝，维持核完整性，为细胞核提供结构支持，并协助DNA修复过程。小鼠胚胎成纤维细胞中A型核纤层蛋白的缺失会诱导基因组不稳定性，表现为基础DNA损伤增加。在辐照骨细胞中，观察到的核纤层蛋白A/C增加可能代表了在暴露后2天内应对照射诱导损伤的一种适应性反应，而振动进一步增强了这种效应。在骨研究中，已表明升高的核纤层蛋白A/C可促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的成骨分化。总之，核纤层蛋白A/C表达增加可能是有益的；然而，由于大多数骨研究集中在MSCs上，核纤层蛋白A/C在骨细胞中的具体作用仍 largely unexplored。在MSCs中，升高的核纤层蛋白A/C也与较高的核刚度相关。几项研究表明，过表达核纤层蛋白A/C的细胞具有更硬的细胞核，能够抵抗变形并限制迁移。一项关于MSCs的研究报告称，需要多次振动才能增加核刚度。类似地，在本研究中，单次振动足以上调F-肌动蛋白表达，而至少需要两次振动才能上调非辐照和辐照骨细胞中的核纤层蛋白A/C。这些发现支持了前述的“由外向内”理论，即振动刺激首先靶向细胞核外的信号通路或结构成分，影响如凋亡和F-肌动蛋白等过程，然后才影响核功能。需要进一步的研究来阐明潜在机制。此外，由于机械刺激也可以通过间隙连接、离子通道、粘着斑和初级纤毛传递，研究它们是否受到处理的影响也将很重要。

除了骨细胞活力和细胞骨架完整性外，骨细胞的一个关键功能是调节其他骨细胞。响应照射，骨细胞表现出RANKL表达增加，从而促进骨吸收性破骨细胞形成，这与我们的骨细胞条件培养基研究一致。虽然振动并未改变破骨细胞的总数，但显著减少了多核巨破骨细胞的形成。这一点很重要，因为先前的研究表明，在细胞数量相同的情况下，较大的破骨细胞比较小的破骨细胞具有更强的骨吸收能力。此外，当将吸收标准化为每个破骨细胞的细胞核数量时，较大的破骨细胞每个细胞核吸收更多的骨，表明作为一个群体，大破骨细胞比较小的更有效。照射的效应也在体内得到证实，照射增加了成熟小鼠的TRAP阳性表面积和破骨细胞活性，同时减少了小梁骨体积。重要的是，我们的RNA-seq数据表明，振动可以减轻照射诱导的骨细胞中骨发育和生长通路的下调。总之，这些发现表明，振动可能通过调节骨细胞信号来减轻照射诱导的骨丢失。通过体内功能和组织学分析进行进一步验证将是至关重要的。

除了在骨重塑中的作用外，骨细胞还调节骨转移。我们和其他人已经表明，从机械负荷骨细胞收集的条件培养基调节乳腺癌行为，结果好坏参半，既有促进也有抑制。这些差异可能归因于剪切应力的变化以及所施加的负荷类型。相比之下，从经受振动的骨细胞收集的条件培养基对癌症迁移没有显著影响。这种效应的缺乏可能是由于机械刺激模式的不同以及需要连续多天的振动才能产生可测量的结果。此外，条件培养基方法不能完全捕捉骨和癌细胞之间的相互作用。为了解决这个限制，我们使用了具有3D lumen通道的微流体平台来模拟骨-癌微环境。我们证明，在振动处理3天后，骨细胞减少了癌症侵袭和外渗。然而，放疗损害了骨细胞调节癌细胞的能力。辐照骨细胞促进了非辐照乳腺癌细胞的侵袭和外渗，而振动减少了癌症外渗。在微流体装置中所有细胞都受到照射的情况下，照射破坏了HUVEC屏障，但总体上仍然减少了癌症外渗。当与骨细胞共培养时，振动进一步减少了乳腺癌侵袭和外渗，表明其作为放疗辅助手段的潜力。重要的是，在没有骨细胞的情况下未观察到这种振动效应，强调了它们在调节乳腺癌转移中的关键作用。最近，Wang等人也从相反的角度处理了这个问题，表明从乳腺癌细胞收集的条件培养基影响了骨细胞功能。再次，条件培养基实验的局限性在于它们只捕捉单向通讯。相比之下，我们的微流体平台更好地模拟了体内发生的双向串扰。当前研究和我们先前的工作都证明，在机械刺激下，骨细胞调节乳腺癌外渗，表明骨细胞功能在乳腺癌细胞存在下得以维持。

骨细胞调节乳腺癌行为的机制最近已被研究，但报告的结果好坏参半。一些研究表明，骨细胞通过TNF-α或通过分泌趋化因子如CXCL1/2在机械负荷下促进乳腺癌进展。相反，其他研究证明了肿瘤抑制作用，表明机械负荷骨细胞通过Cx43半通道抑制乳腺癌迁移。后续研究报告称，骨细胞中Cx43的抗体激活诱导ATP释放，从而激活P2X7受体，从而抑制乳腺癌细胞的生长和迁移。与这种抑制功能一致，使用BML284化学激活骨细胞中的Wnt信号通路通过下调肿瘤促进基因增强了它们的肿瘤抑制活性，减少了小鼠的肿瘤进展。基于这些机制发现，我们检查了骨细胞中各种肿瘤调节通路。值得注意的是，经受振动处理的辐照骨细胞可能通过Wnt信号通路的机械调节抑制了癌症行为。虽然Wnt信号在癌细胞中是致瘤的，但它在骨细胞中支持肿瘤抑制信号。重要的是，抑制辐照骨细胞中的Wnt信号消除了振动诱导的肿瘤促进基因如Ccnd1和Hmga2的下调。Ccnd1与乳腺癌生长和侵袭有关，而Hmga2促进上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）并有助于乳腺癌转移。这些发现突出了Wnt信号在机械刺激下骨细胞中的肿瘤抑制作用。

尽管有这些有希望的发现，我们的研究有几个局限性。首先，虽然MLO-Y4骨样细胞系被广泛接受作为骨细胞机械生物学的模型，但它有已知的局限性。例如，这些细胞缺乏关键标志物如硬化蛋白（sclerostin, Sost）的可检测表达，这对向成骨细胞发出信号很重要；然而，成骨细胞不是本研究的重点。未来的工作将包括成骨细胞连同原代骨细胞，以更好地理解照射和振动下的骨重塑。此外，我们同时使用人源（HUVECs和MDA-MB-231）和小鼠源（MLO-Y4）细胞系可能引起对跨物种变异的担忧。然而，这种方法符合常见做法，因为MDA-MB-231细胞经常用于乳腺癌小鼠模型。HUVECs也广泛用于在MDA-MB-231乳腺癌转移研究中建立内皮屏障，使我们的发现与他人的研究具有可比性。第二，三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种高度侵袭性的亚型，46%的TNBC患者发生远处转移；因此，它适合我们的外渗研究。此外，其缺乏治疗靶点常常需要放疗，使其与本研究的背景相关。然而，TNBC不如雌激素受体（estrogen receptor, ER）阳性乳腺癌普遍，后者约占病例的80%，但ER+乳腺癌被认为侵袭性较低。我们先前的研究报告称，MCF-7 ER+乳腺癌细胞未显著向骨细胞条件培养基迁移。未来的研究应纳入其他癌细胞系，以扩大我们发现的适用性。最后，我们的研究主要集中于体外模型。虽然我们使用微流体平台模拟骨-癌微环境，但它不能完全捕捉患者骨生理学和转移进展的复杂性。进一步的步骤将包括在体内验证这些发现，并进行机制分析，例如相关介体的组织学染色以证实通路参与。此外，LMHF振动的最佳参数，包括频率、幅度和持续时间，仍有待确定，以最大化效应并促进向临床前模型以及最终向临床试验的转化。

结论

虽然基于化学的放射防护策略，如P7C3和PTH1-34，已经引起了相当多的关注，但我们的研究通过探索LMHF振动作为一种减轻放疗诱导并发症的机械方法，提供了一个新颖的视角。我们发现LMHF振动有效减少了骨细胞凋亡，上调了细胞骨架标志物，并恢复了照射后骨细胞对乳腺癌转移的调节。我们的发现为照射诱导骨损伤的细胞基础提供了机制见解，并突出了LMHF振动作为保护骨健康和优化癌症治疗结果的潜在治疗策略。