新型无支架材料——人牙周膜间充质干细胞球体块的性质评估与成骨潜力研究

《Stem Cells International》：Evaluation of the Properties and Osteogenic Potential of a Novel Scaffold-Free Material, Spheroid Blocks Comprising Fused Spheroids of Human Periodontal Ligament Mesenchymal Stem Cells

本文创新性地利用网状模具技术构建了人牙周膜间充质干细胞（hPDLMSC）球体块，系统评估了其干细胞特性（如OCT4、NANOG高表达）及体外/体内成骨能力（RUNX2、COL1、ALP、OCN等基因上调）。研究发现，该球体块几乎无中心坏死，并在小鼠颅骨缺损模型中展现出优于传统球体（联合支架）的骨再生效果，为无支架牙周组织再生治疗提供了新策略。

　　

1. 引言

牙周炎是全球最常见的感染性疾病之一，其病理特征为牙周致病菌引发的慢性炎症，导致牙槽骨等牙周组织破坏。现有牙周组织再生疗法（如釉基质衍生物和引导组织再生）虽已应用于临床，但完全再生牙周组织仍面临挑战。人牙周韧带（hPDL）来源的间充质干细胞（hPDLMSCs）具有多向分化潜能（包括成骨分化），被视为牙周再生的关键细胞来源。三维（3D）球体培养能模拟体内微环境，比二维（2D）单层培养更接近生理状态。然而，传统球体移植需依赖支架材料，可能引发炎症反应、过敏等安全问题，并影响细胞比例和微环境模拟。为解决此问题，本研究采用网状模具法（一种无支架组织工程技术），将hPDLMSC球体融合成块状结构，并探究其特性及成骨潜力。

2. 方法

2.1. 细胞分离与培养

从健康患者拔除的智齿中分离hPDL组织，经胶原酶I和分散酶消化后，培养于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中。使用传代次数少于5次的hPDLMSCs进行实验，其表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146）经流式细胞术验证为阳性。

2.2. 球体块形成

采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微孔芯片（孔径4 mm，深度1.5 mm）制备hPDLMSC球体（接种密度3.0 × 10⁵细胞/孔，培养3天）。将40个球体置于网状模具腔体中，在旋转摇床（45 rpm）中培养7天，促进球体融合形成球体块（尺寸约3.9 mm × 2.9 mm × 1.1 mm）。

2.3. 球体块内部结构分析

通过活/死细胞染色（钙黄绿素/乙锭同型二聚体）和组织学染色（H&E、TUNEL）评估球体块内部细胞存活状态和凋亡情况。图像使用ImageJ软件定量分析。

2.4. 实时定量PCR

提取单层培养、球体及球体块培养的hPDLMSCs在第3天和第10天的总RNA，反转录为cDNA后，通过实时荧光定量PCR检测干性标志物（OCT4、NANOG）和成骨相关基因（RUNX2、COL1、ALP、OCN）的表达水平，以GAPDH为内参基因。

2.5. 成骨诱导实验

将单层培养、球体及球体块组分别置于成骨诱导培养基（OIM）中培养7、14、21天，通过PCR和von Kossa染色（检测钙沉积）评估成骨分化能力。

2.6. 小鼠颅骨缺损移植实验

在36只C57BL/6N小鼠颅骨右侧制造直径3 mm的全层骨缺损，分为3组：空白对照组（缺损不处理）、hPDLMSC球体+Matrigel组（40个球体，1.2 × 10⁷细胞）和hPDLMSC球体块组（1个球体块，同等细胞数）。术后14天和28天处死小鼠，收集样本进行后续分析。

2.7. 微CT分析

使用三维微CT（μCT）扫描颅骨样本，量化骨体积分数（BV/TV）和骨表面积（BS）等骨微结构参数。

2.8. 组织学分析

颅骨样本经4%多聚甲醛固定、莫尔氏液脱钙后，石蜡包埋并切片（4 μm），进行H&E染色。通过ImageJ测量缺损闭合率（新骨宽度/缺损宽度）和新骨形成率（新骨面积/缺损总面积）。

2.9. 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用Student t检验或Bonferroni校正进行组间比较，p < 0.05为显著性差异。

3. 结果

3.1. 球体块形成

hPDLMSC在微孔芯片中形成均一球体（直径约1089 μm），经网状模具培养7天后成功融合为可夹持的球体块，无需载体即可操作。

3.2. 球体块特性表征

活/死染色显示球体块中活细胞占主导，仅重叠区域有少量死细胞；H&E和TUNEL染色证实球体块内部无典型坏死或大量凋亡细胞。PCR结果显示，球体块的干性标志物OCT4和NANOG表达显著高于单层和球体培养（例如第3天OCT4表达较单层高26.7倍，较球体高4.19倍）。

3.3. 球体块的成骨特性

成骨诱导后，球体块的RUNX2、COL1、ALP、OCN基因表达均上调（如第7天RUNX2表达较球体高14.7倍）。von Kossa染色显示球体块内部有黑色钙盐沉积，表明其具矿化能力。

3.4. 小鼠颅骨缺损模型建立

球体块可直接填入骨缺损，而球体组需借助Matrigel载体移植。

3.5. 三维微CT分析

μCT显示，球体块移植组在第28天时新骨形成面积显著高于球体组和空白组，BV/TV和BS参数均明显改善（p < 0.05）。

3.6. 组织学评估

H&E染色表明，球体块组缺损闭合率和新骨形成率均高于球体组（第28天新骨几乎覆盖全缺损宽度），且新骨厚度更大。

4. 讨论

无支架3D培养模型可避免支架相关副作用，网状模具法因其操作简便、成本低、尺寸可控，在牙周再生中具应用潜力。球体块虽由大尺寸球体（直径≈1000 μm）融合而成，但未出现中心坏死，可能与细胞类型和培养条件有关。球体块成骨优势机制或与细胞密度、局部生长因子（如BMP、TGF-β）分布相关，但新骨与宿主骨整合不佳提示需进一步优化。未来可通过改良微孔芯片（如采用多孔基材）、共培养血管内皮细胞构建血管网络，提升球体块存活率和再生效能。

5. 结论

hPDLMSC球体块具良好干性、成骨潜力和低坏死率，在无支架条件下能有效促进骨缺损修复，为牙周组织再生提供了新型策略。