阿克比亚皂苷D通过靶向USP4促进PPARγ去泛素化激活棕色脂肪产热对抗肥胖

《MedComm》：Akebia Saponin D Targeting Ubiquitin Carboxyl-Terminal Hydrolase 4 Promotes Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Deubiquitination and Activation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis in Obesity

本研究揭示了天然化合物阿克比亚皂苷D（ASD）通过靶向泛素羧基末端水解酶4（USP4）促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）去泛素化，从而激活棕色脂肪组织（BAT）产热、改善高脂饮食（HFD）诱导的肥胖的新机制。研究综合运用蛋白微阵列、细胞热位移分析（CETSA）及药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）等技术确证USP4为ASD的直接作用靶点，阐明了ASD-USP4-PPARγ-解偶联蛋白1（UCP1）信号轴在能量代谢调控中的关键作用，为肥胖治疗提供了新的潜在天然小分子药物候选和作用靶点。

　　

小分子化合物库筛选棕色脂肪产热激动剂

为了筛选能够激活棕色脂肪组织（BAT）产热效应的天然活性化合物，研究者从一个包含2542种化合物的天然产物库中，选取了72种与抗肥胖或抗炎症相关的商品化天然化合物。通过UCP1荧光素酶报告基因实验、棕色脂肪细胞中^Ucp1 mRNA丰度评估、棕色脂肪类器官生成及线粒体功能检测等多轮筛选，最终确定阿克比亚皂苷D（ASD）为最稳定的候选化合物。ASD能够显著刺激棕色脂肪细胞中UCP1的转录和蛋白表达，因此被选作后续深入研究其诱导棕色脂肪细胞产热及抗肥胖潜力的化合物。

ASD减轻高脂饮食诱导的小鼠肥胖

研究利用饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠模型验证ASD的抗肥胖作用。结果显示，ASD以剂量依赖性的方式减轻C57BL/6小鼠的体重增长，高剂量组的效果与阳性对照药物二甲双胍（MET）组相当。此外，ASD处理降低了小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和附睾白色脂肪组织（eWAT）的系数和体积。虽然BAT的大小或重量没有显著变化，但其组织颜色在ASD处理后呈现出更明显的红润色泽。血液生化分析表明，ASD显著降低了空腹血糖（GLU）和血脂水平，并对肝功能具有保护作用。组织学分析显示ASD处理后脂肪细胞内脂滴尺寸减小，炎症细胞浸润减少。小动物MRI扫描证实ASD导致体脂减少，但不影响瘦体重。葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）表明，ASD处理以剂量依赖性的方式改善了小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，同时降低了空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数。这些结果表明ASD能有效缓解肥胖及其伴随的胰岛素抵抗。

ASD增加BAT线粒体质量并促进产热，而非通过运动

为证实ASD可激活小鼠产热，研究者使用能量代谢监测系统测量了24小时耗氧量（VO₂）和二氧化碳产生量（VCO₂），并计算了能量消耗（EE）和呼吸交换率（RER）。在DIO小鼠中，ASD给药升高了VO₂、VCO₂和EE，且夜间VO₂高于白天。RER无显著差异，表明小鼠消耗的底物未偏向碳水化合物或脂肪。记录小鼠活动量和摄食量发现，ASD引起的热量消耗增加与运动和饮食因素无关。在4°C冷暴露环境中，ASD处理的小鼠表现出更强的产热能力和更高的体表温度。透射电子显微镜观察显示，ASD有助于缓解HFD引起的BAT线粒体嵴数量减少的损伤。ASD以剂量依赖的方式增加了激素敏感性脂肪酶（HSL）的蛋白丰度，同时BAT中UCP1的免疫组化染色强度增强。BAT转录组测序的通路富集分析显示，与HFD小鼠相比，ASD处理小鼠在产热和氧化磷酸化相关基因上发生了更多改变。ASD显著上调了BAT中包括^Atp5a、^Uqcrc2、^Mtco1、^Sdhb和^Ndufb8在内的产热基因。在体外分离培养的棕色脂肪细胞中，ASD以剂量依赖的方式增加了^Ucp1 mRNA表达和蛋白丰度，并诱导产生更小的脂滴和更高的线粒体活性，同时促进了脂肪分解、产热相关基因（如^Atgl、^Elovl3、^Adrb3、^Dio2、^Prdm16和^Cpt1b）的mRNA表达。这些结果共同表明ASD通过增加BAT线粒体质量促进小鼠产热。

ASD直接作用于棕色脂肪细胞上的靶点USP4

研究首先证实了ASD在RAW264.7巨噬细胞中的抗炎作用，能显著降低脂多糖（LPS）和干扰素-γ（INFγ）诱导的炎症标志物^Il1β、^Il6、^Nos2的表达及炎症因子IL6、TNFα的释放。同时，ASD处理减轻了DIO小鼠BAT和eWAT中巨噬细胞浸润形成的冠状结构。为确定ASD的主要靶细胞，研究者将巨噬细胞条件培养基作用于棕色脂肪细胞，并通过海马能量代谢分析发现，ASD是直接作用于棕色脂肪细胞而非通过巨噬细胞间接影响产热。为识别ASD的具体靶点，研究综合运用了生物素标记的ASD（Bio-ASD）结合HuProt蛋白微阵列、药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）和细胞热位移分析（CETSA）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术。三种方法的交集结果显示，泛素羧基末端水解酶4（USP4）是ASD唯一共同的直接作用靶点。DARTS和CETSA结合Western blot验证了ASD与USP4的结合能减少USP4被蛋白酶和温度降解。微量热泳动（MST）实验测得ASD与USP4的结合亲和力常数为37.8 ± 28.0 μM。分子对接预测ASD可与USP4（PDB ID: 2Y6E）结合。然而，ASD并不显著影响USP4催化底物Ub-Rh110的降解活性。使用去泛素化酶（DUB）抑制剂PR-619或小干扰RNA（siRNA）敲低^Usp4表达，均可逆转ASD对棕色脂肪细胞氧消耗速率（OCR）和^Ucp1 mRNA表达的上调作用。ASD处理不改变^Usp4 mRNA水平，但以剂量依赖的方式增加了USP4蛋白丰度，并通过环己酰亚胺（CHX）实验证实ASD抑制了USP4蛋白的降解。这些结果表明ASD直接作用于USP4，并且USP4与UCP1依赖性产热密切相关。

USP4通过促进PPARγ去泛素化增强UCP1依赖性产热通路

鉴于敲低USP4抑制了^Ucp1 mRNA表达，研究者推测USP4可能调控UCP1上游转录因子的泛素化水平。通过抗USP4抗体的免疫共沉淀（Co-IP）结合LC-MS/MS，发现了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的特征肽段，Western blot和免疫荧光共定位分析进一步证实了USP4与PPARγ之间存在相互作用。在棕色脂肪细胞中，ASD处理正相关地增加了USP4、PPARγ和UCP1的蛋白水平，同时增加了促进长链脂肪酸进入线粒体的肉碱棕榈酰转移酶1B（CPT1B）蛋白丰度和磷酸化HSL（p-HSL）水平，但未显著影响脂滴包被蛋白PLIN1。在冷暴露环境或ASD处理的DIO小鼠BAT中，也观察到USP4与PPARγ蛋白水平的正相关。使用PR-619抑制USP4活性或siRNA敲低^Usp4表达，均降低了PPARγ蛋白丰度，并逆转了ASD对PPARγ的上调作用。值得注意的是，ASD不影响PPARγ mRNA水平，提示其调控可能发生在蛋白酶体通路。使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白质合成抑制剂CHX的实验证实，PPARγ的降解确实由蛋白酶体途径介导。在293T细胞中过表达USP4显著抑制了PPARγ的降解。随后的泛素化实验进一步证实USP4能够对PPARγ进行去泛素化。为确定PPARγ泛素化的类型，研究者构建了保留特定赖氨酸位点（K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63）的泛素突变体，结果显示PPARγ主要通过K48连接的泛素链发生泛素化。综上所述，ASD介导的产热机制涉及USP4介导的PPARγ去泛素化。

USP4与肥胖相关；ASD的作用依赖于USP4

为探究ASD对小鼠的抗肥胖作用是否依赖于USP4，研究者向UCP1-cre小鼠尾静脉注射表达USP4短发夹RNA的慢病毒（Lentivirus-shUSP4），以降低BAT中^Usp4的表达。与对照慢病毒（Lentivirus-GFP）相比，注射Lentivirus-shUSP4显著抑制了BAT中USP4的表达。ASD能减轻Lentivirus-GFP小鼠的体重增长，但在Lentivirus-shUSP4小鼠中，这种效应被完全消除。同样，敲低USP4显著抑制了ASD诱导的BAT脂肪细胞面积减小和血脂降低能力。ASD给药显著上调了Lentivirus-GFP小鼠BAT中UCP1和PPARγ的蛋白丰度，但在Lentivirus-shUSP4小鼠BAT中无此效果。敲低USP4加剧了小鼠的胰岛素抵抗，并削弱了ASD的治疗效果。利用杂交小鼠多样性 panel（HMDP）数据库进行的相关性分析显示，脂肪组织中^Usp4 mRNA表达与高脂/高糖DIO小鼠的线粒体DNA拷贝数呈正相关，而与体重、内脏脂肪重量及稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）呈负相关。这些结果共同证实了USP4在ASD介导的BAT产热激活中的重要作用。

讨论

本研究利用UCP1报告基因系统和棕色脂肪类器官进行高通量筛选，发现了天然小分子ASD能通过UCP1依赖性途径增加棕色脂肪细胞中UCP1的转录和表达。ASD在体内可缓解HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗，有效激活BAT产热，保护BAT线粒体免受HFD损伤，上调氧化磷酸化和产热相关基因。ASD是中药续断的主要活性成分，既往研究报道其可改善代谢综合征、缓解骨骼肌胰岛素抵抗和治疗肝脂肪变性，本研究首次揭示了其对脂肪组织产热的促进作用。ASD在巨噬细胞中表现出抗炎活性，并能减轻脂肪组织炎症浸润，但其促产热作用被证实是直接作用于脂肪细胞而非通过巨噬细胞介导。通过结合生物素标记蛋白微阵列、DARTS和CETSA-LC/MS-MS等多种技术，研究者将USP4确定为ASD的直接作用靶点。本研究阐明了ASD通过靶向USP4，促进其对PPARγ的去泛素化作用，从而激活PPARγ-UCP1轴，最终促进BAT产热对抗肥胖的分子机制（ASD-USP4-PPARγ-UCP1轴）。USP4的下调与胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等相关，HMDP数据库分析也显示肥胖小鼠脂肪组织中USP4表达降低，提示其作为肥胖治疗靶点的潜力。虽然ASD与USP4的UBL2区域结合并不影响其酶催化活性，但能抑制USP4蛋白的降解，具体机制有待进一步研究。本研究也存在一些局限性，例如未探讨白色脂肪组织棕色化是否参与该过程、ASD是否可能通过神经信号调控BAT UCP1表达、USP4的表观遗传修饰类型、USP4与PPARγ的直接相互作用及体外去泛素化反应验证、ASD长期给药的潜在毒性以及其他可能的作用靶点等，这些均为未来研究指明了方向。