全套综合离子对介导的阴离子交换色谱法结合离子对反相液相色谱法对消化后的信使核糖核酸药物成分进行指纹图谱分析

《Journal of Chromatography Open》：Full comprehensive ion-pair-mediated anion exchange chromatography?×?ion-pair reversed-phase liquid chromatography fingerprinting of digested messenger ribonucleic acid drug substances

mRNA药物质量控制中，本研究开发了两维液相色谱（LC×LC）平台，结合离子对介导的阴离子交换色谱（IPAX）和离子对反相液相色谱（IPRP），通过单次RNase T1消化的全序列覆盖实现mRNA药物指纹分析，显著提升正交性和分辨率，成功区分eGFP和Raxtozinameran mRNA样本。

　　随着mRNA药物在治疗多种疾病和作为高效疫苗领域的应用日益增加，对这些新型药物进行分析方法开发的需求也相应增长。传统的分析方法通常依赖于Sanger测序、下一代测序（NGS）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等手段，这些方法虽然能够确认mRNA药物的序列身份，但往往需要进行多次部分消化，使用不同的RNase酶来获得足够的序列覆盖度。这种自下而上的LC-MS方法在实际操作中存在一定的复杂性和资源消耗。

在本研究中，提出了一种全面的二维液相色谱（LC×LC）平台，通过离子对介导的阴离子交换色谱（IPAX）作为第一维，离子对反相液相色谱（IPRP）作为第二维，并结合凸包模型（convex hull model）对色谱方法的正交性进行了评估。这种平台可以用于mRNA的指纹分析，从而通过一次完整的RNase T1消化来区分不同的mRNA。此外，该方法还可以用于确认mRNA的序列身份，或与高分辨率质谱（HRMS）结合，以提高测序效率。

mRNA药物的结构特征与天然mRNA相似，包括5’端的帽结构（如7-甲基鸟苷，m7G），通常通过三磷酸桥连接到第一个核苷酸，以及3’端的多聚腺苷酸尾（polyA-tail），通常由约100-150个腺苷酸组成。这些结构对于mRNA的稳定性和翻译效率至关重要。为了提高翻译效率，一些mRNA药物设计为将polyA-tail切割成两部分，并通过短链连接。这种设计已被用于BioNTech的Comirnaty?疫苗中，以增强翻译效率。此外，分支型polyA-tail也被开发出来，显示出提高mRNA药物翻译能力的潜力。

为了确保mRNA的序列分析质量，LC-HRMS技术常用于药物物质的表征。然而，这种方法在实际应用中仍存在诸多挑战，例如需要复杂的样品前处理、昂贵的HRMS设备以及缺乏分析的稳健性。此外，其他如NGS、Sanger测序或纳米孔测序等方法，往往难以自动化，对短且低丰度的转录本具有较高的错误率，或需要更复杂的数据分析。

离子对反相液相色谱（IPRP）因其在分析高度亲水的磷酸化分析物如寡核苷酸和mRNA方面的良好分离性能，已成为核苷酸分析的黄金标准。通常使用的离子对试剂是三乙胺（TEA）的乙酸盐形式，但一些更疏水的离子对试剂如三丙胺或辛胺，能够提供更好的分辨率。然而，使用强离子对试剂如丁胺或己胺时，由于其浓度限制和对ACN的高需求，导致分离效果不佳。

在本研究中，选择了三种不同的离子对试剂（辛胺、己胺和三丙胺）用于第二维的IPRP色谱分析。结果显示，三丙胺在第二维分离中表现出最佳的分离性能，因此被选为最终的离子对试剂。此外，对第一维的优化也进行了详细研究，发现使用TMAC（四甲基铵氯化物）作为离子对试剂比使用NaCl更优，因为它能提供更高的峰容量，并且在二维分离空间中表现出更广泛的分布。

为了评估二维色谱方法的正交性，采用凸包模型（convex hull model）进行分析，该模型基于Delaunay三角剖分法，能够更准确地反映色谱分离的空间利用率。结果显示，使用TMAC和IPRP的组合方法比使用NaCl和IPRP的组合方法具有更高的正交性（31% vs. 22%），这表明该方法在二维色谱分离中能够更好地区分不同mRNA的碎片。

此外，研究还对二维色谱方法的重复性进行了评估。通过三次独立的RNase T1消化实验，分析了eGFP mRNA和Raxtozinameran的指纹图谱。结果显示，指纹图谱在第一维和第二维均表现出良好的重复性，其中第一维的相对标准偏差（RSD）在0.25%以下，而第二维的RSD则略高，约为1.0%。这些结果表明，该二维色谱方法具有足够的稳定性，可用于mRNA药物的质量控制。

最后，研究展示了该二维色谱方法在区分不同mRNA药物中的应用。通过比较eGFP和Raxtozinameran的指纹图谱，发现它们在二维色谱空间中表现出显著的差异，尤其是在polyA-tail的分布和碎片的分辨率方面。这表明，该方法在mRNA药物的分析中具有重要的应用价值，能够为质量控制和测序提供更精确的分析手段。未来的研究方向包括进一步优化正交性，例如测试HILIC（液相色谱）方法，以及提高第二维色谱的质谱兼容性，以实现更全面的mRNA分析。